基于荧光定量PCR鉴定冷鲜肉制品中羊源性成分及其含量

史莹莹,邵俊锋,郭 娟,许慧卿

(扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127)

羊肉鲜嫩,营养丰富,中医上具有助元阳、补精血、疗肺虚、益劳损的功效,是进补的佳品。我国是羊肉生产和消费大国,群众对羊肉及肉制品的需求量日益增加[1]。欧洲的“马肉风波”对肉制品市场影响巨大,国内挂羊头卖狗肉的假羊肉事件屡见不鲜。用低廉的肉进行掺假,这涉及经济、营养、食品安全甚至宗教信仰等问题。

目前对肉类种属鉴别的方法主要有:以特征形态为基础的感官鉴别、以蛋白质为基础的免疫学鉴别方法以及以核酸聚合酶链式反应为基础的分子生物学技术等[2-3]。感官鉴别属于粗略鉴别法,且检测结果容易受实验人员的主观因素影响[4]。由于加工处理过程中蛋白质的质量受肉制品的新鲜度、加工程度等因素的影响,蛋白质性质不稳定,存在干扰结果且重复性差[5-6]。聚合酶链式反应(PCR)是利用特异性引物体外扩增目的DNA片段,然后对所得DNA片段进行分析从而达到鉴别物种的目的。常见的PCR技术有常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR、DNA测序等[7-8]。自从1998年Tartaglia等[9]首次报道基于普通PCR方法检测饲料中的牛、羊源性成分,PCR鉴定物种的方法日趋成熟。何玮玲等[10]利用Cytb基因的差异性位点,设计了相同上游引物但下游各自特异性的4条PCR引物,建立了一种快速定性鉴别猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉成分的多重PCR方法。微滴数字PCR精确度高但实验成本昂贵以及实验条件要求高且操作复杂[11]。实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入染料或者探针等荧光基团,通过荧光信号强度变化实时监控反应中DNA浓度的变化,从而实现对肉类产品进行鉴定[12]。范丽丽等[13]选择Taqman实时荧光PCR技术,专门针对牛细胞色素b设计引物和探针,以Ct值在28以内确定牛源性成分的存在。Farrokhi等[14]运用SYBR Green1实时荧光方法对清真认证猪源性成分检测,通过Tm值显示扩增特异性,其猪肉最低检出限达0.1 ng/μn。但目前利用荧光定量PCR检测方法对肉制品掺假成分进行定性定量的检测还鲜有报道。因此,在对羊肉种属定性鉴定的基础上,拟建立一种对冷鲜羊肉制品中羊肉成分含量的定量检测方法。考虑到检测的精准度、操作的难易以及实验成本的合理性,选择实时荧光定量方法进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生鲜猪、牛、羊、鸡、鸭肉及肉制品 扬州市大型农贸市场超市;血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ Takara公司;TE缓冲液、引物 生工生物工程(上海)股份有限公司。

StepOne Real-time PCR仪 Applied Biosystems,USA;Nanodrop2000核酸蛋白定量仪Thermo Scientific,USA;DYY-11型电泳仪 北京市六一仪器厂;Tanon3500凝胶成像一体机 上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 分别取1 g生鲜猪、牛、羊、鸡、鸭肉充分剪碎,置于预冷洁净的研钵中,用液氮研磨至粉末状,在粉末未解冻前快速转入5 mL洁净离心管,-70 ℃保存。

1.2.2 混合样品的制备 精确称取生鲜猪、羊肉(精确度0.0001 g),按质量比混合,得到羊肉质量百分比为10%、30%、50%、70%、90%和5%、15%、45%、65%、95%总质量为1 g的猪羊肉混合肉样。液氮研钵处理保存方法同1.2.1。

1.2.3 DNA提取 采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取的样品总DNA。取50 mg上述样品于1.5 mL洁净离心管,按提取说明书稍做改进,加入蛋白酶K消化时间延长至6 h直至肌肉组织溶解,后按说明继续操作。将提取的样品DNA溶于80 μL TE洗脱液中,于-20 ℃保存备用。

1.2.4 DNA浓度和纯度测定 取TE为空白调零,取2 μL样品,用核酸蛋白测定仪测定提取后的DNA模板的浓度、A260/A280及A260/A230比值。2%琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA提取效果。

1.2.5 实时荧光PCR体系

1.2.5.1 引物设计 根据美国NCBI GenBank数据库公布的羊线粒体细胞色素b基因序列(登录号MH938654.1),运用Primer Premier 5.0软件设计筛选对羊有特异性的PCR扩增引物RTY。采用相对定量法,选择在结构和功能上具高度保守性的16S rDNA作为内参管家基因[15],并且设计一对内源基因引物16S。16S上游引物:5′-ACCGTGCAAAGGTAGCAT AATCA-3′,下游引物:5′-GCTCCATAGGGTCTTC TCGTCTT-3′,产物大小82 bp。RTY上游引物:5′-GGGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-3′,下游引物5′-GATTTTTCGCCTTTCACTTTATT-3′,产物大小243 bp。引物交于上海生工合成,用无菌无酶水溶解,配制成100 μmol/L的储备液。

1.2.5.2 PCR反应 反应体系10 μL:TBGreen Premix Ex TaqⅡ(TliRNaseH Plus)(2×)5.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX Reference Dye(50×)0.2 μL,DNA模板1.0 μL,灭菌水3.0 μL。两步法PCR扩增程序:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火 30 s,共40个循环。对熔解曲线进行分析,无引物二聚体和非特异性产物。

1.2.6 引物特异性研究 以市售新鲜的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉5种畜禽肉DNA为模板,浓度统一稀释至50 ng/μL,各取1 μL,用RTY引物进行实时荧光PCR反应,分析RTY引物扩增的物种特异性。

1.2.7 内参引物通用性 研究以市售新鲜的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉5种畜禽肉DNA为模板,浓度统一稀释至50 ng/μL,各取1 μL,用16S内参引物进行实时荧光PCR反应,分析内参引物对常见物种扩增的通用性。

1.2.8 引物灵敏度检测 将提取的羊肉DNA原液稀释至50 ng/μL,然后进行5倍系列梯度稀释,即50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2、0.64 pg/μL等梯度,去离子水作为阴性对照模版,进行实时荧光PCR检测。

1.2.10 模拟混合肉样检测 以总质量50 mg且已知质量比为5%、15%、45%、65%、95%猪羊混合肉样,分别提取DNA,浓度统一至50 ng/μL。进行实时荧光PCR反应。以16SrDNA作为内参,将ΔCt值带入1.2.9所建立的标准曲线中计算羊源性成分质量百分比。和实际质量百分比做商,计算其回收率,以检验标准曲线的准确性。

1.2.11 市售羊肉制品检测 在大型农贸市场或者超市采购羊肉制品包括羊肉串、肥羊卷、熟食羊肉等。将样品置于灭菌水浸泡漂洗后提取DNA,按1.2.5所述实验条件、体系进行实时荧光PCR反应。检测是否含有羊源性成分,并通过ΔCt值计算样品中羊肉含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 DNA浓度和纯度测定结果

不同肉类DNA浓度和纯度测定结果见表1。核酸提取过程中容易混入蛋白质及碳水化合物等杂质。A260/A280>1.8可以说明溶液中无蛋白质污染,A260/A230比值可以帮助判断核酸溶液中是否混有糖类等杂质,当A260/A230<2.0时,则说明DNA溶液被碳水化合物污染[16]。由表1可知,取的生鲜猪、牛、羊、鸡、鸭肌肉组织DNA A260/A280、A260/A230比值符合上述要求,未被污染。提取的生鲜猪、牛、羊、鸡、鸭肌肉组织DNA经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示,条带清晰无拖尾且完整。说明提取的DNA可用于实时荧光PCR反应。

表1 DNA浓度和纯度测定结果Table 1 DNA concentration and purity test results

图1 2%琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 2% agarose gel electrophoresis注:泳道1:生鲜猪;泳道2:生鲜牛;泳道3:生鲜羊;泳道4:生鲜鸡;泳道5:生鲜鸭。

2.2 实时荧光PCR引物特异性、内参引物通用性检测结果

用引物RTY对不同肉的DNA模板进行实时荧光PCR扩增反应,结果如图2所示。羊DNA模板的16个循环之后即进入指数扩增期,而猪、牛、鸡、鸭模板则在28个循环之后,无酶水则>30。羊肉模板和其他肉类Ct值差异明显,以去无酶水作为阴性对照,引物RTY对非目标物种荧光扩增效率差[17]。即设计的引物RTY对羊源性成分特异性较高。

图2 引物RTY对不同肉类DNA的扩增曲线Fig.2 Amplification curves of DNA samples derivedfrom different meats using RTY primer

用内参引物16S引物对不同肉的DNA模板进行实时荧光PCR扩增反应,结果如图3所示。16S对常见的5种畜禽肉有较好的扩增效率,Ct值相对稳定,集中在狭窄范围内。结果表明,内参引物16S具有通用性,可以作为内参校正基因使用[18]。RTY引物和内参基因16S的熔解曲线Tm值分别为82.86 ℃(图4)和77.97 ℃(图5),均为特异的单个峰。熔解曲线则结果表明没有引物二聚体和其它非特异性峰的存在,目标片段具有高度特异性。

图3 引物16S对不同肉类DNA的扩增曲线Fig.3 Amplification curves of DNA samples derivedfrom different meats using 16S primer

图4 引物RTY扩增熔解曲线Fig.4 Melting curves of prime RTY

图5 内参引物16S扩增熔解曲线Fig.5 Melting curves of internal reference primer 16S

2.3 引物RTY灵敏度检测

为检测引物RTY的灵敏度,将提取的羊肉DNA原液稀释至50 ng/μL,5倍系列梯度稀释,以去离子无酶水作为阴性对照。对浓度50 ng/μL～0.64 pg/μL的模板DNA进行检测,结果如图6所示。当模板浓度低至16 pg/μL时,仍清晰地进行指数扩增。浓度再低时扩增曲线差别小,且和阴性对照结果接近。实验结果表明,本方法检测限可达16 pg/μL。

图6 引物RTY对不同DNA浓度梯度的扩增曲线Fig.6 Amplification curve for different DNAconcentration gradients of primer RTY

2.4 标准曲线的建立

不同羊肉含量的标准品进行实时荧光反应,其对应的Ct值结果表2所示。以标准品中羊肉含量百分对数值lg(羊肉质量含量百分比%)为横坐标,标准品对应的循环阈值差值ΔCt(ΔCt=Ct羊肉-Ct内参)为纵坐标,得到肉质量百分比的对数值与ΔCt的线性关系,绘制羊肉质量百分比的对数值与ΔCt值之间的标准曲线(图7)。经Excel模拟出标准曲线回归公式为y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,PCR的反应效率E(%)=(10-1/k-1)×100(k为标准曲线斜率),标准曲线E=96.62%。《实时荧光定量国际化标准-MIQE指南》规定:R2>0.980以及90%<扩增效率E<105%。结果表明,本标准曲线具有良好的线性关系和扩增效率,符合实时荧光定量国际化标准的要求。

表2 不同羊肉含量百分比Ct以及ΔCt值检测结果Table 2 Ct and ΔCt value of differentbeef content percentage standards

图7 羊肉质量百分比的对数值与ΔCt值之间的标准曲线Fig.7 Standard curve between the log value ofmutton mass percentage and the corresponding ΔCt value

模拟含羊肉质量为5%、15%、45%、65%、95%的猪羊混合肉样品,按1.2.5反应体系进行检测。将所得实时荧光PCR测得的数据的ΔCt值代入标准曲线中计算羊肉质量含量百分比,并且计算回收率,以检验标准曲线及定量测定的可行性,结果如表3所示。结果表明,检测的羊肉质量含量百分比与模拟的混合猪羊肉中羊肉质量含量百分比实际值符合程度高。回收率为93.07%～106.20%,较为理想。本试验建立的量化肉制品中羊肉成分的实时荧光相对定量方法具有实践意义。

表3 模拟混合肉样Ct值检测结果Table 3 Ct value of simulated mixed meat sample

2.6 市售羊肉制品检测结果

选择市售8份羊肉制品提取DNA,样品均来自某市大型农贸市场及超市。样品包括羊肉串、羊肉卷、熟食羊肉等。利用建立的实时荧光PCR反应体系检测其羊源性成分,每个样品设置三个平行,市售羊肉制品的羊肉质量百分比检测结果如表4所示。其中有3份含量达98%以上,3份含量低于50%,2份含量在60%左右。从市售抽样结果看,确实存在掺假羊肉制品欺骗消费者的不法现象,相关部门需加强监管以及打击力度。

表4 市售羊肉制品检测结果Table 4 Results for quantitative test the commercial meat mixtures

选择实时荧光PCR方法,以羊线粒体细胞色素b为靶位基因,设计出对羊有特异性扩增的引物。在检测结果能是否检出的羊源性成分定性判断基础上,选择16S rDNA为内参引物,外源性基因以及内参基因联用进行检测。羊肉质量百分比的对数值与之对应的循环阈值差值ΔCt呈良好线性关系。标准曲线回归公式为y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,扩增效率达E达96.62%。本试验中羊源性DNA检测限可达16 pg/μL。通过对标准曲线进行质量评估,证明该方法适用于对羊肉成分的鉴定以及含量的检测。本方法不需要设计复杂又昂贵的荧光探针,封闭体系无需后续的电泳以及紫外拍照等操作,很大程度缩短了检测时间,并且减少PCR产物污染避免假阳性,实验结果较为准确。现行有效的对牛羊源性成分的定性检测国标方法仅适用于饲料中(GB/T 20190-2006)[19],还没制定出牛羊肉制品相关的国标检测方法,本方法可为其研究提供参考意见。本文仅提出了针对生鲜冷冻肉制品的羊源性成分的鉴定以及含量测定的方法,对不同加工方法之后的肉制品鉴定方法还需进一步探究。