响应面法优化固相酸水解鲍鱼脏器多糖工艺

孙 冲,杜阿珠,姚昱锟,陈锦权,方 婷1,,*

(1.闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心,福建福州 350002;2.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

鲍鱼(Haliotisdiscushannai)素以名贵著称,因其高营养价值,一直深受着消费者喜爱[1],但如今大多数食品加工厂对鲍鱼的加工只局限于对其肉质的利用,而占鲍鱼重量1/4的鲍鱼脏器往往被直接丢弃或做饲料处理[2]。鲍鱼脏器被人们称为“鲍鱼肝”,含有丰富的蛋白质、多糖、鱼油等高活性物质及微量元素[3],直接丢弃会造成资源浪费,鲍鱼脏器中的重金属还会造成环境污染[4]。重金属含量超标及鲍鱼毒素[5]制约鲍鱼脏器的利用,因此如何合理地开发利用鲍鱼下脚料,将这些废弃物变废为宝,创造出更多的经济效益,受到社会的关注[6]。

已有研究发现鲍鱼脏器中含有丰富的多糖类化合物[7],鲍鱼因其长期生存在高盐、低温缺氧、光照不足的环境中,使得鲍鱼多糖往往具有独特的生物活性,如降血脂[8]、抗氧化[9]、抗凝血[10]、抑菌[11]、抗肿瘤、免疫调节[12]等。但多糖类物质一直受限于粘度大、分子量大、不易散、不利于人体吸收利用[13]等缺点,所以其应用范围变得很狭窄。多糖降解为寡糖后,会发生分子量降低,结构简化[14],溶解性增强等变化,同时寡糖较多糖低毒性,因此寡糖一直是研究热点。寡糖相对分子量小、易于溶解、易被吸收,较其它糖类化合物表现出更为显著的生物活性,具体表现为抗氧化[15]、抗肿瘤[16]、抗凝血[17]等,因而备受人们的关注,所以确定多糖水解最佳条件就显得尤为重要。鲍鱼脏器寡糖(abalone viscera oligosaccharide,AVO)是由鲍鱼脏器多糖(abalone viscera polysaccharide,AVP)降解而来的聚合度较低的低聚糖,目前对鲍鱼脏器寡糖的研究少有报道。

本文利用固相酸(732#阳离子交换树脂)降解多糖,水解条件温和,且水解过程中不会引入其他杂质,树脂可以回收利用,并以多糖水解率为指标,结合响应面法(response surface methodology,RSM)优化多糖水解条件,确定了固相酸水解多糖的最佳工艺条件,同时采用葡聚糖凝胶柱层析和红外光谱分析对降解产物进行了分离纯化[18]和结构测定,以期为鲍鱼的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲍鱼脏器多糖(AVP) 本试验前期制备并纯化[19];硫酸、氢氧化钠、无水乙醇、95%乙醇、葡萄糖、苯酚(结晶酚)、磷酸、牛血清蛋白、浓盐酸、氯化钠 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;732#阳离子交换树脂 武汉华众新化工有限公司;氯仿 分析纯，杭州高晶精细化工有限公司;正丁醇 分析纯,浙江杭州双林化工试剂厂;考马斯亮蓝G-250 分析纯,北京恒业中远化工有限公司。

LG-1.0真空冷冻干燥机 沈阳航天新阳速冻设备制备有限公司;L-550台式低速离心机、DD5大容量离心机 长沙湘仪离心机有限公司;JJ600电子天平 常热市双杰测试仪器厂;R205旋转蒸发器 上海申生科技有限公司;PH SJ-3F pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;UV-6300PC紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;BT-100电脑恒流泵、SBS-100-LCD自动部分收集器、HD421-88紫外检测仪 上海琪特分析仪器有限公司;HWS28电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;DHG-9240A电热恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;冰箱 西门子公司;VERTEX 70傅里叶红外光谱仪 德国布鲁克BRUKER。

1.2 实验方法

1.2.1 鲍鱼脏器多糖水解工艺 称取质量为0.1 g鲍鱼脏器多糖,加入100 mL蒸馏水,向其中加入一定质量的732#阳离子交换树脂,在基础实验温度下反应不同的时间。反应完毕后立即用1 mol/L NaOH溶液调pH至中性,离心(7000 r/min,15 min),除去树脂及水不溶性残渣,上清液加入无水乙醇,使最终乙醇体积分数为70%,静置过夜,离心(7000 r/min,15 min),除去乙醇不溶性残渣,上清液减压蒸发近干,冷冻干燥即得鲍鱼寡糖[20]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 树脂用量对多糖水解率的影响 称取0.1 g鲍鱼脏器多糖,加入100 mL蒸馏水,加入质量为10、20、30、40、50、60 g的732#树脂,按1.2.1中方法在水浴温度为70 ℃的条件下降解3 h,测定鲍鱼脏器多糖水解率。

1.2.2.2 水解时间对多糖水解率的影响 称取0.1 g鲍鱼脏器多糖,加入100 mL蒸馏水,加入质量为30 g的732#阳离子交换树脂,按1.2.1中方法在水浴温度为70 ℃的条件下降解1、2、3、4、5 h,测定鲍鱼脏器多糖水解率。

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1.2.2.3 水解温度对多糖水解率的影响 称取0.1 g鲍鱼脏器多糖,加入100 mL蒸馏水,加入质量为30 g的732#阳离子交换树脂,按1.2.1中方法在水浴温度分别为50、60、70、80、90 ℃的条件下降解3 h,测定鲍鱼脏器多糖水解率。

1.2.3 响应面优化设计 根据单因素实验的结果,进行响应面试验。采用Design Expert 8.0.6 数据统计分析软件对试验数据进行回归分析确定数学模型。每一个自变量的低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码,该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程,因素水平设计见表1。

表1 实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 还原糖含量测定及水解率计算 本试验水解后的寡糖混合物中还原糖含量的测定采用DNS法。参考彦繁鹤等对甘蔗中还原糖的测定[21]。测定还原糖的含量后,按下式计算多糖水解率。

1.2.5 寡糖分离 本试验对所得的鲍鱼脏器寡糖进行凝胶层析,选用Sephadex G-25(100 cm×1.5 cm)凝胶层析分离纯化鲍鱼脏器寡糖,准确称取一定量的Sephadex G-25,在蒸馏水中进行溶胀,充分溶胀后去除上层悬浮的细小颗粒,把处理好的Sephadex G-25先进行半小时的超声波清洗器脱气,保持浸湿状态,并缓慢倒入层析柱中,待其自然沉降后,用蒸馏水平衡一天。加少量蒸馏水将鲍鱼脏器寡糖充分溶解,上层析柱,洗脱剂为蒸馏水,通过恒流泵控制流速为1.0 mL/min,每6 min收集一管,采用苯酚-硫酸法[22]检测每管在490 nm处的吸收峰,以洗脱管数为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制洗脱曲线。将收集到鲍鱼脏器寡糖组分减压浓缩后冷冻干燥,得到鲍鱼脏器寡糖。

1.2.6 红外光谱分析 称取样品2 mg,与200 mg的经过干燥的KBr放在玛瑙研钵里,研磨混匀,压片,用傅里叶变换红外光谱仪在500～4000 cm-1波长区域内进行红外扫描[23],从而确定糖苷键的构型及观察其他官能团。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 树脂用量对多糖水解率的影响 图1为树脂用量对多糖水解率的影响,由图1可知,多糖水解率随树脂用量先上升再下降,当树脂用量为40 g时,多糖水解率最高,水解率为77.8%,故最佳树脂用量为40 g。相比于伍毅等[24]利用盐酸水解大枣多糖的研究,固相酸水解多糖的水解率变化更加平缓,这表明相比于盐酸水解多糖,固相酸水解条件更加温和,且水解过程中不会引入其他杂质,阳离子树脂可以回收重复使用,更加绿色环保。

图1 树脂用量对多糖水解率的影响Fig.1 Effect of resin dosage on thehydrolysis rate of polysaccharide

2.1.2 水解时间对多糖水解率的影响 水解时间对鲍鱼脏器多糖水解率有一定影响,由图2可知,在1～3 h时,多糖水解率呈上升趋势,多糖水解率在50%～80%之间,当时间长于3 h后,多糖水解率趋于平缓,水解率基本保持在76%,不再发生明显变化,与牛放等[25对野菊花多糖水解时间的研究一致,表明多糖水解率已经达到最大释放量,故从能源利用效率考虑,水解最适时间为3 h。

图2 水解时间对多糖水解率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time onhydrolysis rate of polysaccharide

2.1.3 水解温度对多糖水解率的影响 由图3可知,随着水解温度上升,多糖水解率增加,在70 ℃时,水解率达到最高,为76%。水解温度是影响鲍鱼脏器多糖水解率的一个重要因素,随着温度升高,分子运动加剧,多糖糖苷键被酸分子破坏的几率增加,从而可以提高水解率[26],但随着温度的继续升高多糖水解率开始下降。而野菊花[25]、紫菜[27]、猴头菇[28]等多糖水解率随水解温度上升会趋于平衡,造成这一差异的原因一方面是树脂达到了其耐受温度,自身结构遭到破坏,催化降解能力逐渐降低[29];另一方面是水解温度升高会导致产物中糖发生复分解反应,生成了糠醛等非糖副产物[30],从而使得还原糖含量下降,引起水解率减小,故最佳水解温度为70 ℃。

图3 水解温度对多糖水解率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperatureon hydrolysis rate of polysaccharide

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面分析因素水平的确定 在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken的中心组合设计原理,以3个主要因素树脂用量、水解时间和水解温度为自变量,以3次试验所得鲍鱼脏器多糖水解率的平均值为响应值(Y)设计三因素三水平的响应面分析试验,具体的设计与结果如表2。

表2 响应面分析方案与结果Table 2 RSM analysis scheme and results

2.2.2 响应面试验结果 采用Design Expert 8.0.6 软件进行统计分析,得到回归方程:Y=80.69+0.61A+1.91B+2.75C-0.66AB+0.027AC-0.81BC-3.15A2-3.31B2-3.30C2

为了体现回归方程的有效性及各因素对水解率的影响程度,对二次多元回归方程进行了方差分析,结果如表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established native regression model

2.2.4 响应曲面分析 响应曲面图和等高线图能够直观反应出各因素间交互作用的强弱。响应曲面坡度越陡峭,说明各因素间的交互作用越显著,响应曲面越平缓,说明各因素的交互作用越弱;等高线为椭圆形时,说明各因素间的交互作用越强,等高线越趋近于圆形时,说明各因素间的交互作用较弱。图4(a)为树脂用量和水解时间之间交互作用的结果,当水解温度一定时,随着树脂用量和水解时间的增加,多糖水解率先升高再降低,响应曲面明显,有明显的峰值。图4(b)为树脂用量和水解温度之间的交互作用,由图可知,温度升高可以增加水解率,但温度过高会影响树脂结构和水解产物,多糖水解率下降。图4(c)为水解时间和水解温度之间交互作用的效果,从图中可以看出,多糖水解率随着两者的增加先升高再降低,有明显的最大值。从等高线图可以直观看出,各交互项等高线图近似圆形,说明各因素间交互作用不显著,与表3中显著性检验结果相吻合。由响应曲面最高点及等高线图知,在所选范围内存在峰值即响应曲面最高点,也是等高线图的中心点。

图4 各因素交互作用对多糖水解率影响的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of interactions among different factors on polysaccharide hydrolysis rate

2.2.5 多糖水解率最优值的确定及验证试验 利用Design Expert 8.0.6 软件进行分析确定各因素的最优值为:树脂用量A=40.26 g,水解时间B=3.14 h,水解温度C=70.01 ℃,多糖水解率的预测值Y=80.19%。结合实际操作将各因素的最佳值修正为树脂用量40 g,水解时间3 h,水解温度70 ℃。在此条件下进行3次平行验证,最终鲍鱼脏器多糖水解率为80.69%,接近且略高于预测值,因此,响应面法优化鲍鱼脏器多糖水解条件是可行的。

目前对鲍鱼脏器寡糖制备的研究还少有报道。Wu等[31]通过中心复合设计优化利用过氧化氢水解牡蛎多糖制备寡糖,寡糖产量为10.61%;邓宇峰等[32]采用酶法水解龙须菜琼胶,多糖水解率为56.6%;和法涛等[28]利用硫酸酸解猴头菇多糖并通过正交试验优化,多糖水解率为70.11%。本实验通过响应面法优化鲍鱼脏器多糖水解条件,相比于其它多糖,鲍鱼脏器多糖水解率为80.69%,水解率较高,具有一定的实际应用前景和价值。

2.3 鲍鱼脏器寡糖的分离纯化

采用Sephadex G-25 凝胶柱对鲍鱼脏器寡糖混合物进行分子量分级,鲍鱼脏器寡糖混合物在凝胶柱上的洗脱曲线如图5所示。曲线在第13管和第29管出现两个洗脱峰,第13管的洗脱峰尤为明显,表明鲍鱼脏器寡糖混合物中以这两个组分为主,且第13管的组分占绝大部分。收集第13管的鲍鱼脏器寡糖组分,合并洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥,得鲍鱼脏器寡糖产物。

图5 寡糖混合物的洗脱曲线Fig.5 Elution curve of oligosaccharide mixture

2.4 鲍鱼脏器寡糖的红外光谱分析

图6 AVO红外吸收光谱Fig.6 The infrared absorption spectrum of AVO

3 结论

利用固相酸水解鲍鱼脏器多糖制备寡糖,通过单因素实验研究了树脂用量、水解时间和水解温度对鲍鱼脏器多糖水解率的影响,并用响应面法对鲍鱼脏器多糖水解工艺进行优化,得到最佳水解条件为:树脂用量40 g,水解时间3 h,水解温度70 ℃。在该条件下进行3次平行试验,得到鲍鱼脏器多糖水解率为80.69%,接近且略高于预测值,表明对鲍鱼脏器多糖水解工艺的优化是可行的,为鲍鱼脏器的开发利用提供了参考,最后使用葡聚糖凝胶柱层析和红外光谱分析对降解产物进行了分离纯化和结构测定,表明鲍鱼脏器寡糖含有吡喃环,为α-型糖。