鸡禽流感H5、H7和H9抗体水平合格率检测

熊 鑫

（安徽省宁国市农业农村局，安徽 宁国 242300）

1 试验方法

1.1 样本制备

①于屠宰环节随机选取某养殖场鸡祖代（80周龄）及父母代（48周龄）各50只；

②通过翅静脉采集血液，于37℃放置2h；

③取上清液在1800r/min条件下离心2～3min，用移液器吸取上层清液（即为血清）于新的离心管中；

④进行编号标记后于-20℃保存。

1.2 制备1%鸡红细胞悬液

①注射器吸取适量阿氏液，通过翅静脉采集健康公鸡血液；

②于1500r/min条件下离心8～10分钟，用移液器尽可能吸净上层清液弃去；

③加入生理盐水通过称量配平后，用移液器重复吹打使悬液充分混匀；

④重复②③步骤3～5次；

⑤离心后将上层清液弃掉，用生理盐水配成1%红细胞悬液，置于4℃保存备用。

1.3 HA试验

①取1块96孔V型微量反应板水平放置于实验台，进行标记；

②分别选取6排，其中每2排为重复操作，第1～12孔分别加入25μL生理盐水；

③分别于相应标记的第1孔加入H5、H7和H9抗原25μL，倍比稀释至第11孔，弃去枪头内液体；

④6排的每孔加入25μL生理盐水；

⑤6排的每孔加入配制好的25μL 1%红细胞悬液，振荡混匀后于37℃恒温箱内反应15～20分钟；

⑥观察结果，获得抗原血凝效价，制备抗原稀释液。

1.4 HI试验

①取96孔V型微量反应板进行标记；

②每块板第1～11孔每孔内加入25μL生理盐水，第12孔则加入50μL；

③于反应板每排的第1孔、第6孔加入对应血清样本25μL，分别倍比稀释至第5孔、第10孔，弃去枪头内液体；

④于第1～11孔加入25μL配制好的H5抗原稀释液，振荡混匀，于37℃反应15～20分钟；

⑤每孔加入25μL 1%红细胞悬液，振荡混匀后放置于37℃反应15～20分钟；

⑥结果判定，获得抗体水平；

⑦根据以上方法测得H7和H9抗体水平效价。

2 试验结果

2.1 HA试验

以完全血凝的病毒稀释倍数往前推进2个滴度即为我们需要的四个血凝单位，如图2-1结果显示H5抗原的稀释倍数为1：28。H7抗原的稀释倍数为1：28。H9抗原的稀释倍数为1：27。根据结果分别配制H5、H7和H9抗原稀释液，标记后置于4℃备用。

2.2 HI试验

根据试验结果，读取血清的红细胞凝集抑制效价，分析结果发现，H5抗体合格率中祖代和父母代的均为100%；H9抗体合格率同样为100%；H7合格水平率中祖代的为78%，父母代的为72%。本次试验样本的检测结果发现H5、H7和H9抗体水平合格率均较高，并且符合农业部对禽流感抗体水平合格率的相关要求。

该样本经过免疫H5、H7和H9疫苗，经结果分析发现各疫苗免疫之间互不干扰，均可达到其预期效果，产生较高的抗体水平。

1：HI试验结果-H5；2：HI试验结果-H7；3：HI试验结果-H9

表2-2 HI试验结果

3 结果分析

HI试验结果显示，祖代与父母代的免疫效果合格率无明显差别，且经检测发现H5和H9的抗体水平合格率均达到了100%，H7抗体水平合格率分别为78%和72%，也达到了70%以上，根据农业农村部相关公告，H7N9群体免疫合格率需要达到70%以上（家禽抗体滴度≥24），相关农业部门才可出具动物检疫合格证明，可跨省调运。在抗体合格率上，H5和H9的抗体合格率高于H7的抗体合格率，这可能由不同病毒株之间的不同特性导致，因此，在利用HI试验检测进行免疫评估时不得不注意其中的差异。本次试验结果该养殖场屠宰环节中采集的祖代及父母代样本的禽流感H5、H7和H9抗体合格率均达到相关要求。