调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

马文龙 ， 刘延峰 ， 吕雪芹 ， 李江华 ， 刘 龙 ， 堵国成 *

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

N-乙酰氨基葡萄糖 （N-acetyl-glucosamine，GlcNAc），又称为2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是一种具有生物活性的氨基单糖。GlcNAc及其衍生物 （氨基葡萄糖，N-乙酰-D-神经氨酸和1，6-脱水N-乙酰胞壁酸）在药品和保健品领域有着广泛的应用，比如因其具有消炎和抗肿瘤的作用，与硫酸软骨素组合使用替代塞来昔布治疗关节炎，可以避免塞来昔布的副作用；作为膳食补充剂，可以增强人的免疫力[1-3]。另外，研究表明GlcNAc作为药物辅料，由于其溶解性好，安全性高，无副作用，可以作为化学交换饱和转移磁共振成像对比剂应用于肿瘤诊断[4-5]。而且，利用氨基葡萄糖将金纳米颗粒-石墨烯氧化物官能化后，可以降低非特异性毒性，提高抗菌活性，将其作为一种有效的抗菌剂，在制造医疗器械和废水处理中具有良好的应用潜力[6-7]。

在之前的研究中，我们通过阻断重组枯草芽孢杆菌中心碳代谢副产物乙偶姻溢流，得到GlcNAc高产菌株BSGN10，其在3 L发酵罐中恒pH补料分批发酵，GlcNAc产量可达48.9 g/L[8]。然而在摇瓶发酵中，由于乙酸的积累，抑制了细胞生长和GlcNAc合成，限制了后续菌株改造。解决乙酸溢流的方法有许多，如强化内源乙酰CoA合成酶 （编码基因acsA）或异源琥珀酰-CoA-乙酸CoA转移酶（编码基因aarC）表达，增强细胞同化乙酸的能力，将乙酸转化为乙酰-CoA，为GlcNAc合成提供乙酰基供体；虽然该方法可以减弱乙酸毒性，但由于琥珀酰-CoA在反应中转化为琥珀酸，琥珀酸（pKa=4.21）与乙酸（pKa=4.75）具有相近的解离常数，琥珀酸的积累也会产生毒性[9-10]；而且该方法可能会形成乙酸—乙酰-CoA—乙酸之间的无效循环，从整体经济性考虑，这不是解决乙酸溢流的较优策略。也可以异源表达异柠檬酸裂解酶（编码基因aceB）和苹果酸合酶（编码基因aceA）构建乙醛酸循环体，减少乙酸生成，但乙醛酸循环体与GlcNAc合成途径竞争前体AcCoA，不利于GlcNAc合成[11]。由于乙酸可以经乙酰辅酶A（Ac-CoA）合成酶AcsA催化生成Ac-CoA，为GlcNAc的合成提供前体，所以为了促进GlcNAc的合成和乙酸的利用，作者对AcsA的表达进行了调控，见图1。

已有研究表明，全局转录调控因子CodY通过结合到acsA 5′UTR区域阻碍转录，抑制酶AcsA的表达[12-17]；而且AcsA翻译后在K549位点受乙酰化修饰而失活[18-19]。为了提高酶AcsA的表达量和活性，作者首先对CodY结合位点进行了突变，以解除全局转录调控因子CodY对acsA转录的抑制；在此基础上，对AcsA549位的Lys进行定点饱和突变，解除乙酰化修饰。通过以上改造，使得acsA的转录水平提高了43%，AcsA胞内比酶活提高到66.7 mU/mg。最终在摇瓶发酵中乙酸积累量降低至3.6 g/L，相比出发菌株降低了43%；同时GlcNAc产量提高到5.0 g/L，相比出发菌株提高了163%。该研究思路与方法为解决枯草芽孢杆菌乙酸溢流提供了借鉴，为进一步提高GlcNAc产量奠定了基础。

图1 重组枯草芽孢杆菌中GlcNAc合成途径及乙酸代谢途径Fig.1 Synthetic pathway of GlcNAc and metabolism pathway of acetate in Bacillus subtilis

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒 本研究所用的菌株和质粒详见表1。

1.1.2 主要试剂 Prime STAR （max）DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、T4 DNA连接酶以及定量PCR试剂盒：购自TaKaRa公司；限制性内切酶EcoR I和DpnI：购自Thermo公司；酵母粉和蛋白胨：购自Oxoid公司；其他常规试剂：均为国产分析纯；引物合成及测序：均由上海生工有限公司完成。实验中，博来霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的添加质量浓度分别为 25、25、100 μg/mL。

1.1.3 培养基 LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH 7.4。

发酵培养基（g/L）：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸铵6，葡萄糖60，磷酸氢二钾15，硫酸镁3，七水硫酸亚铁0.06，无水氯化钙 0.06。

表1 本文所用的菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 实验方法

1.2.1 质粒pcreK的构建 pcreK构建过程见图2。首先以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，以pcrek-L-F和pcrek-L-R为引物，扩增得到creK-L；再将质粒p7Z6用限制性快切酶EcoR I线性化；然后以胶回收后的creK-L为大引物，以EcoR I线性化的质粒p7Z6为模板扩增，将PCR产物直接转化E.coliJM109，次日用引物pcrek-L-F/pcrek-L-R进行菌落PCR验证，并挑取条带大小约2 000 bp的克隆子测序确认[21]。其次，以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，以pcrek-R-F和pcrek-R-R为引物，扩增得到creK-R；然后以胶回收后的creK-R为大引物，直接扩增上述得到的阳性克隆子，PCR产物经 DpnI消化后转化E.coliJM109，次日用引物pcrek-R-F/pcrek-R-R进行菌落PCR验证，并挑取条带大小约850 bp的克隆子测序确认，得到质粒pcreK。所用引物序列见表2。

1.2.2 acsA 5′UTR区域内CodY结合位点的突变首先，在质粒上对CodY结合位点进行相应突变。以质粒pcreK为模板，选取适当引物，按照Quik Change Site-directed Mutagenesis kit进行定点突变。然后，挑取测序正确的阳性克隆子，以引物对CreKL-F/CreK-L-R扩增后柱回收PCR产物，转化BSGN10，对基因组上相应位点进行突变。

1.2.3 AcsA K549饱和突变 AcsA K549饱和突变采用兼并引物的方式进行。首先，以pcreK为模板，以K549-F/K549-R为引物，在质粒上对AcsAK549进行饱和突变。然后，挑取测序正确的阳性克隆子，以引物对CreK-L-F/CreK-L-R扩增后柱回收PCR产物，转化BSGN10，对基因组上相应位点进行突变。

1.2.4 GlcNAc摇瓶发酵 种子培养：挑取平板上新鲜转化的单菌落接种到25 mL LB液体培养基（250mL平底三角瓶）中于37℃、220 r/min条件下培养8～10 h。

图2 pcreK质粒的构建Fig.2 Construction of plasmid pcreK

摇瓶发酵：将种子液按接种体积分数5%接入50 mL发酵培养基中 （250 mL挡板三角瓶），在37℃、220 r/min条件下培养48 h。

1.2.5 检测方法 发酵液中GlcNAc、乙酸和葡萄糖质量浓度用HPLC检测[8]；乙酰辅酶A合成酶活性通过检测反应液中NADH吸光值的变化测定[22]；蛋白质质量浓度用碧云天Bradford试剂盒测定。

表2 本文所用的引物及序列Table 2 Primers used in this study

2 结果与讨论

2.1 CodY结合位点突变对acsA转录和乙酸积累的影响

全局转录调控因子CodY在革兰氏阳性菌中非常保守，其通过感知胞内GTP和支链氨基酸浓度，感知胞外营养物质变化，通过改变对不同结合位点的亲和力，改变对不同基因的结合，调控相应基因的表达和胞内碳氮代谢流分配，适应胞外环境的变化[12，15，17]。 如图 3（a）所示，在acsA5’UTR 区域内，CodY结合序列为tATaTTtTaAAAATT（小写碱基表示与保守序列的差异；CodY结合回文保守序列为AATTTTCWGAAAATT，红色碱基表示最保守的碱基）[14]。Belitsky B R和Sonenshein A L通过突变保守的A10，解除了CodY对ispA、rapA和rapE的抑制[17]。作者在借鉴Belitsky B R和Sonenshein A L研究的基础上，对回文序列中A10、A10-A11及对应的T6及T5-T6进行了突变，以减弱CodY的结合，并将t7、a9分别突变为C7、G9，以增强CodY的结合，作为对照。

如图3（b）所示，将保守碱基突变为其他碱基均不同程度地促进了基因acsA的转录。其中，最保守碱基A10突变效果尤其明显，突变株CodY-5和CodY-6中acsA转录水平分别提高了35%和43%，同时乙酸积累量分别降低了15%和23%，为5.5 g/L和 5.2 g/L。虽然 T6、T5-T6 与 A10、A10-A11 在回文序列中处于对应的位置，但是突变后效果并不明显，CodY-1和CodY-2中acsA转录水平仅仅提高了5%和12%，乙酸积累量也仅仅降低了5%和8%，为6.4 g/L和6.2 g/L。同时，将非保守碱基t7、a9分别突变为保守的C7、G9后，对acsA转录和乙酸利用都没有明显的影响。基于以上分析，选择突变株CodY-6进行下一步的改造。

图3 CodY结合位点突变对acsA转录和乙酸积累的影响Fig.3 Effects of CodY binding sequences mutation on acsA transcription and acetate accumulation

2.2 AcsAK549饱和突变对AcsA酶活和乙酸积累的影响

乙酰化与磷酸化类似，调控着生物体内许多重要的生理功能，如受体信号转导、RNA处置和代谢控制等[23-24]。如图4（a）所示，枯草芽孢杆菌乙酸利用途径也受乙酰化调控，该途径中的关键酶AcsA在其Lys549位点被乙酰基转移酶AcuA乙酰化，导致其活性丧失，利用乙酸的能力降低。虽然在大肠杆菌中已有通过调控AcsA表达促进乙酸利用的报道，但是在枯草芽孢杆菌中很少有相关的报道[22，25]。

为了探究AcuA乙酰化对乙酸利用的影响，作者对其乙酰化位点进行了突变。如图4（b）所示，将Lys549突变为其他19种氨基酸虽然可以解除乙酰化修饰，但是由于不同氨基酸其空间位阻或者带电荷性质的不同，对酶AcsA活性和乙酸利用的影响也不尽相同。将Lys549突变为碱性氨基酸Arg或者His，对乙酸利用没有明显影响；而将Lys549突变为酸性氨基酸（Asp，Glu）或极性中性氨基酸（Cys，Met，Gln，Asn，Ser，Thr，Trp，Tyr），不利于乙酸利用；当将Lys549突变为非极性氨基酸Gly和Pro时，明显促进乙酸利用，乙酸积累量分别减少了25%和19%，为3.6 g/L和4.0 g/L。乙酸积累量的减少，说明通过突变解除乙酰化修饰后，提高了酶AcsA的活性。如图4所示，将Lys549突变为Gly后胞内比酶活为66.7 mU/mg，相比BSGN10-CodY6提高了44%，相比出发菌株BSGN10提高了76%。

2.3 GlcNAc摇瓶发酵

虽然以上研究表明，通过促进乙酸利用途径中AcsA转录以及通过解除乙酰化修饰可以提高AcsA的活性，促进乙酸的利用，但是其对细胞生长和产物GlcNAc合成的影响仍然未知。为了考察调控AcsA表达对枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc性能的影响，挑选乙酸产量显著降低的菌株BSGN10-CodY6和BSGN10-CodY6-AcsAK549G进行摇瓶发酵，与出发菌株BSGN10进行了比较。

如图 4（d）所示，发酵 30 h后，菌株 BSGN10-CodY6和BSGN10-CodY6-AcsAK549G的GlcNAc产量分别为3.2 g/L和5.0 g/L，是出发菌株BSGN10的1.7和2.6倍；同时菌株BSGN10-CodY6和BSGN10-CodyY-AcsAK549G的生物质积累量（DCW）分别为 3.5 g/L和 5.3 g/L，是出发菌株BSGN10的1.3和1.9倍。以上结果表明，调控AcsA表达不但可以促进乙酸利用，而且可以提高菌株的发酵性能。

3 结语

增强枯草芽孢杆菌对乙酸的利用能力，提高其发酵性能，对于代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产高附加值的生物化学品具有重要的意义。已有研究通过在枯草芽孢杆菌中构建乙醛酸循环，促进Ac-CoA与乙醛酸缩合生成苹果酸，通过促进Ac-CoA的消耗，促进乙酸的利用[11]。但是对于GlcNAc的生产而言，由于需要Ac-CoA为GlcNAc提供乙酰基，构建乙醛酸循环会减少Ac-CoA的供给，不利于GlcNAc的合成。由于Ac-CoA合成酶AcsA以乙酸为底物，催化其转化为Ac-CoA，可以为GlcNAc提供乙酰基，所以促进酶AcsA的表达不但可以提高菌株利用乙酸的能力，而且可以提高其发酵产GlcNAc的性能。由于GlcNAc的合成消耗Ac-CoA，可以促进乙酸的利用，为了进一步提高重组枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的能力，后续研究将通过强化GlcNAc合成途径中关键酶GNA1和GlmS的表达，加强Ac-CoA的消耗，继续减少或消除乙酸积累。

图4 AcsAK549饱和突变对乙酸积累、AcsA酶活和GlcNAc合成的影响Fig.4 Scheme of the AcsA acetylation and its effects on acetate utilization and GlcNAc production