莴笋霜霉病抗性材料选育方法

李家慧，徐冬梅，黄海涛，文 静，王治斌，牛义松，张 杰

(四川省绵阳市农业科学研究院，四川 绵阳 621023)

莴苣(Lactucasativa L.)属菊科(Compositae)莴苣属(Lactuca L.)，根据产品器官分为茎用莴苣和叶用莴苣，其中茎用莴苣又称莴笋、青笋和莴苣笋等。喜冷凉气候，是四川种植面积较大的蔬菜种类之一。随着市场需求的增多和品种类型的不断丰富，在四川平坝地区可四季种植。霜霉病是四川地区莴笋的主要病害，一般在冬春季节，特别是早春阴雨天发病较重，若防治不当，可造成减产10%以上，甚至绝收。市场上尚无抗霜霉病的莴笋品种，使得生产上仍以药剂防治为主，不仅增加了生产投入，还不利于莴笋的无公害生产。

抗病育种在国内其他蔬菜上早有应用，王惠哲等[1]通过苗期人工接种抗病性鉴定，筛选出黄瓜褐斑病高抗材料3份和抗病材料2份。但是，关于莴笋抗性鉴定和抗源筛选进展尚未见报，尤其是莴笋抗病育种方面在国内几乎是空白。在国外，Michelmore[2]研究表明莴苣对霜霉病的抗性是由显性单基因控制。分子标记辅助选育研究，能针对市场需求高效地选择优良品种，这对蔬菜育种效率具有很大的提升，如刘秀村[3]利用RAPD标记并结合BSA法，在大白菜DH群体中筛选出与桔红心基因连锁的标记。本文详细介绍了通过杂交技术培育莴笋抗霜霉病新材料的操作方法，以及利用分子标记辅助育种和田间鉴定相结合的抗性鉴定方法，可提高目标资源鉴选效率和准确性，加快抗性材料选育的获得和品种选育进程。

1 抗性鉴定

莴笋霜霉病在田间遇到连续阴雨天气，就会快速蔓延扩展。四川地区在冬春季节种植的莴笋发病较多。选育抗霜霉病材料，在该病害流行季节，将所选材料放在病圃里，使感病生育期与病害发生流行时期相吻合，采用自然诱发和人工接种结合进行鉴选，按照莴笋霜霉病病害分级法分级(见表1)进行田间调查。

表1 莴笋霜霉病病害分级标准

根据其病情指数，按照感染霜霉病的程度(高抗、抗病、中抗、感病、高感)(见表2)筛选优良株系或单株留种。

表2 莴笋霜霉抗性型划分标准

2 杂交季节选择

四川地区莴笋杂交在春秋两季均可进行，一般选择春季。因为，春季温度较适宜，莴笋由陆续开花到盛花期时间较长，保证了充足的杂交时间。春季杂交的播种时间为9月中下旬至10月上中旬，定植时间为10月中下旬至11月下旬，翌年4月上旬便可开始杂交。露地杂交最适宜时间集中在4月中下旬至5月上中旬，5月下旬开始，温度升高，莴笋开花快，不利于去雄。

四川地区秋季也可进行杂交，但秋季雨水多，露地杂交较难开展，效果也较差。一般选择在大棚种植，播种时间为7月份，杂交时间为9月中下旬。秋季种植大棚莴笋，开花期易遭到果实蝇为害花蕾，所以在花期前要做好防治。与春季相比，秋季花期短，结籽受光照影响较大，效果不如春季。

3 剥离法杂交

3.1 时间

由于莴笋花的结构特别、开花时间短，导致杂交难度很大。莴笋的花为舌状花、花小，柱头包裹在花药里面，一朵花由20多朵舌状小花组成，它属于高度自交作物，有研究认为莴苣的自然杂交率不到3%[4]。其花无法在蕾期去雄，只能在开花期进行，因为一朵花的花期仅持续2～2.5h。莴笋开花时间随着温度和光照的不同而变化，一般晴天温度越高，则开花时间越早，根据天气情况，晴天的最佳去雄授粉时间为早上7:00～8:30，一般情况下，最佳去雄授粉时长为1.5h左右，在晴天的早上，每人每天可完成40～50朵花的杂交；阴雨天气，莴笋在上午10:00后开花，阴雨天由于花粉上有水珠，不利于去雄，所以选择在晴天早上进行杂交。

3.2 杂交方法

3.2.1 去雄 晴天的上午9:30之前，选取母本植株花朵花冠伸出但未展开前，食指和中指夹住花托底部，用力向花朵中心吹一口气，使每一朵小花的花冠散开，露出花药管，便于去雄。手持小镊子轻轻夹住花药管中上部，向外拔出，只拔出花药管，用力要均衡，用力过大，会将花药管里面的柱头一起拔出，拔出花药管后，可以看到柱头。莴笋花是有20多朵舌状小花组成，分2～3轮排布，需仔细检查每一朵舌状小花的花药管是否去除干净，如果有拔断或损坏的花药管残留在小花中，则将整个舌状小花去除。去除花药管的过程要小心，避免损伤整朵花，不利于结籽。

3.2.2 冲洗 整朵小花的花药管彻底去除干净后，用小喷壶向整朵花喷清水冲洗，冲洗散落、残留的花粉。之后，用力向花朵吹气，吹掉花朵内的水珠，再将去雄后的花朵反复冲洗3～4次，每次均要吹掉花朵内的水珠。最后，给去雄的花朵罩上防虫网袋，避免蜜蜂或其他昆虫飞落在上面，沾染了其他花粉。

3.2.3 授粉

等待整朵花水珠完全干后，雌蕊柱头呈“Y”字状展开，采摘完全开放的父本花朵，给去雄后的母本授粉，拿父本花朵在去雄后的母本花朵上轻轻蘸1～2次，可以看到黄色的花粉沾到母本花的柱头上，即完成授粉。在授粉后的母本花花托部位系一根细绳作为杂交标记，并挂上标记牌。授粉后，花朵不会马上闭合，要罩上防虫网袋。在授粉后的10～15d可以采收莴笋杂交种子。

4 分子标记

在莴笋霜霉病田间抗性鉴定和诱导发病的基础上，选取抗病株系作为父本，和感病株系作为母本进行杂交获得F1，F1自交获得F2分离群体，对分离群体中的100个子代和2个亲本开发高密度分子标签，进行遗传图谱构建和相关性的QTL关联分析，获得与性状紧密关联的分子标签和候选区域。利用遗传图谱进行QTL定位，比较基因组，辅助基因组组装等科研工作，这不仅拓宽了育种手段，同时加快了育种进程。

5 应用

通过对6份材料进行杂交，抗病材料2份，感病材料1份，获得了330份杂交组合，其中，抗病性较好的优良组合8份。通过遗传图谱构建和相关性状的QTL关联分析，获得了与性状紧密关联的分子标签和候选区域，构建了遗传连锁图谱，明确了霜霉病在莴笋中遗传规律，为加快品种选育进程和抗病材料的高效利用提供科学依据和指导。