睡眠剥夺动物模型最新研究进展

厚玉姣　石晓静　苗雯蓉　韩易　巴剑波

摘要 为研究建立新型且模拟度更高的睡眠剥夺模型，本文系统回顾近年来国内外常用的动物睡眠剥夺模型，分析及评价其在睡眠机制研究中的应用。指出中医药研究中睡眠剥夺模型应用尚不完善，提出基于简单生物模型研究生物钟基因的作用及分子调节机制将是未来研究的热点内容。

关键词 综述;睡眠剥夺;动物模型

Recent Research Progress on Animal Sleep Deprivation Models

HOU Yujiao1，SHI Xiaojing1，MIAO Wenrong1，HAN Yi1，BA Jianbo2

（1 Neurology department of naval characteristic medical center，Shanghai 200000，China; 2 Research Department of naval characteristic medical center，Shangha 200000，China）

Abstract In order to establish a new and more simulated sleep deprivation model，this paper reviews the animal sleep deprivation models commonly used at home and abroad in recent years，analyzes and evaluates their application in the study of sleep mechanism.It is pointed out that the application of sleep deprivation model in traditional Chinese medicine researches is not perfect.Further studies should consider the function and molecular regulation mechanism of biological clock gene based on simple biological models.

Keywords Review;Sleep Deprivation;Animal Models

中图分类号：R338.63文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2020.04.076

睡眠在人类、哺乳动物、鸟类和爬行动物中普遍存在，它是一种以警觉性和反应性降低为特点的活跃状态，这种状态是快速可逆的并具有极其重要的生理意义[1]。充足的睡眠对保持身心健康很重要，然而近1/3的成年人每天的睡眠时间少于6 h[2]。慢性睡眠不足会导致心血管疾病，代谢异常。急性睡眠剥夺或功能障碍也可能导致葡萄糖代谢改变、激素分泌改变和体质量增加[3]。睡眠时间减少也会导致认知功能受损，Shirley L.Zhang等[4]发现长期失眠使肠道微生物群发生不健康的转变，最终可影响“肠-脑”轴改变认知功能，严重的睡眠剥夺甚至可以导致死亡。虽然中医没有睡眠剥夺这个概念，但是睡眠剥夺动物模型广泛应用于中医中药改善睡眠机制的研究中。通过研究动物睡眠，可以深入了解人类睡眠机制和功能，进而有效认识疾病发生、发展规律。本文就近年来一些常用动物睡眠剥夺模型的制作及评价进行系统的回顾，现将结果报道如下。

1 分类综述

1.1 睡眠剥夺模型动物选择

1.1.1 哺乳动物 动物睡眠研究主要分为模型研究法和比较研究法。前者通过监测模型生物的类人睡眠状态来了解人类睡眠，这些模型生物需要接受一系列实验操作。而模型的生物效用通常受睡眠与人类睡眠相似程度的限制，历史上模型生物的研究重点是哺乳动物。哺乳动物生物钟包括位于下丘脑视交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）内的“主时钟”和位于身体其他组织内的“外周生物钟”。“主时钟”起着“交响乐队指挥”的作用，引导“外周生物钟”通过某种未知路径使动物适应其进食、活动和新陈代谢，以适应环境中可预测的日常变化。生物钟通过时间调节基因表达来协调生理节律，以控制核心生物钟基因和节律输出程序。研究发现生物存在转录-翻译反馈回路网络，该网络由核心转录激活因子（Bmal1和Clock）和抑制因子（Per和Cry）组成，控制基因表达的节律性[6]。而癌症驱动基因的TP53、MYC以及多功能核受体（Nuclear Receptor Superfamily，NRS），包括Revib、Ror和Ppar家族[7]，也是昼夜节律钟的重要调节器。目前有几种关于睡眠时间的可能机制，提示体质量与睡眠的关系可能起着关键作用，较轻的体质量代表更高的代谢率和睡眠[8]，也有研究表明大脑体积与睡眠周期中各阶段的长度呈正相关[9]，虽然多数研究都阐述过睡眠，但对于哺乳动物而言，仍然没有任何方法可以预测睡眠发作的持续时间，不同生物其睡眠结构存在异质性，生物钟均不能完全模拟人类的睡眠周期及时相。

啮齿类动物作为低等哺乳动物与人类睡眠稳态和神经生化调节机制相似，较常用于睡眠剥夺模型的建立，同时具有易繁殖、饲养，手术操作简单及经济的优势。经皮层脑电描记发现龋齿类动物睡眠-觉醒呈现一定节律性。大鼠各睡眠周期由不同睡眠时相构成，各睡眠时相持续时间较短，转换频繁。虽然大鼠睡眠呈片段化，但随着睡眠潜伏期延长，大鼠累积觉醒总时间呈同步增加趋势，累积睡眠总时间呈同步减少趋势。大鼠并不能由觉醒状态（Wake）直接进入慢波睡眠（Slow Wave Sleep，SWS），需经历浅睡眠期，同时也不能直接进快入速眼球运动睡眠（Rapid Eye Movement Sleep，REM），需经历NREM阶段[10]。Sprague-Dawley和Wistar是2種常用的杂交鼠，Wistar较Sprague-Dawley有显著高的睡眠总量比值L/D，因此，光照期睡眠剥夺的Wistar有可能表现出黑暗期睡眠总量的明显增加。尤为重要的是，大鼠体质量和性别对睡眠均有影响，表现为睡眠时相的差异，与人类睡眠有相似之处[11]。在进行睡眠剥夺和脑电记录时，应充分考虑到上述因素。

一些高级哺乳动物，例如猫、狗、海豚等也用于睡眠剥夺模型的构建。2010年R Ursin等人[12]研究猫完全睡眠剥夺对睡眠波形的影响。Wu MF等人在《美国生理学杂志》发表新发现的下丘脑神经肽，食欲素与嗜睡症的病因有关。研究发现[13]48 h不进食不会引起狗脑脊液下丘脑分泌素1（Hypocretin-1，HCRT-1）水平的显著变化。然而与基线水平相比，24 h睡眠剥夺使狗HCRT-1水平增加70%，与人类有相似的表现。由于海豚睡眠状态与安静时的清醒状态很难区分，研究者需在宽吻海豚局麻后将电极植入皮质（硬膜外、皮质内等）的位置，进行睡眠监测。通过拍打水面来唤醒动物，或通过微弱电刺激海豚鳍状肢进行睡眠剥夺的实施[14]。

1.1.2 简单模式生物 哺乳动物睡眠结构的复杂性引发了研究者对简单模式生物的兴趣，如线虫、果蝇和斑马鱼，即使模型生物不能模拟人类睡眠的各个方面，但它们仍然具有重要的研究价值。近年来，果蝇（黑腹果蝇）已经成为一种强有力的睡眠模型。果蝇繁殖周期短，且建模方法相对成熟。当果蝇静止状态大于5 min时，即处于睡眠状态。人类基因与果蝇的同源性高达80%，这些同源基因功能保守，在人类和果蝇中承担着相似的生物学功能。目前利用基因修饰技术已培育出失眠果蝇（insomnia-like，ins.1）[15]，可以从基因角度进行睡眠障碍发生机制的研究。与哺乳动物相比，鱼类主要依据白天的光照保持觉醒状态，即使被剥夺1晚的睡眠，斑马鱼也不会在第2天白天打瞌睡。这引起了科学家浓厚的兴趣，因此夜间重复光照刺激是斑马鱼常用于睡眠剥夺方式。近期研究发现生物钟蛋白per3通过斑马鱼体内的组胺和GABA信号促进其睡眠稳态，与人类有相同之处[16]。简单模式生物不仅具有类似于哺乳动物的睡眠或睡眠相似状态，也具有啮齿动物所不具备的研究优势。

1.1.3 其他模式生物 鸟类和哺乳动物的睡眠有很多相似之处。在NREM睡眠期间，脑电图显示高振幅慢波，与哺乳动物一样，鸟类的慢波似乎反映了神经元膜电位在动作电位的去极化“开启状态”和神经元静止状态的超极化“关闭状态”之间的缓慢振荡[17]。最近一项研究发现在短期（8 h）睡眠剥夺后鸽子脑电图显示SWA增加[18]。爬行动物在行为和体植物学上表现出与鸟类和哺乳动物慢波睡眠和异相睡眠相似的2个睡眠阶段[19]，研究者通过构建蜥蜴鬣蜥睡眠剥夺模型，进一步打开研究睡眠机制的大门。

1.2 睡眠剥夺动物模型的建立 保持长时间觉醒的不同方法常用于研究睡眠剥夺可能产生的神经生理影响。目前界定睡眠的行为标准为：1）自发且具有特定姿势;2）保持行为的不动性;3）行为反应阈值升高，反映在唤醒刺激的强度和/或行为反应的频率、潜伏期或持续时间;4）外界刺激下行为快速可逆[20]。目前常用于研究神经生理的动物睡眠剥夺模型。见表1。

1.2.1 睡眠剥夺法 睡眠剥夺法根据剥夺时相分为异相睡眠剥夺法和全睡眠剥夺法。

1.2.1.1 异相睡眠剥夺法（Paradoxical Sleep Deprivation，PSD） 又称快速动眼相睡眠剥夺法。是选择性睡眠剥夺常用的方式。龋齿类模型生物均利用了大鼠畏水的特点，主要包括水平台环境剥夺法，水上网格法等。经典水平台法由Cohen等[21]于1966年首次建立用于大鼠的睡眠剥夺实验。此后演变出多平台及改良多平台的大鼠睡眠剥夺模型。直径6 cm的平台可用于大鼠最大程度的异相睡眠剥夺，小鼠多使用2.4 cm小平台。改良多平台则将对照组由小平台改大平台，或者平台下放置尼龙网防止大鼠跌落入水。水上网格法增加了大鼠活动范围，消除了固定和隔离的干扰，大鼠可以自由活动。平台模型主要用于REM选择性睡眠剥夺，但均对慢波睡眠造成干扰，一定程度上影响实验结果稳定性，网格法则对环境应激有所消除。见表2。

1.2.1.2 完全睡眠剥夺法（Total Sleep Deprivation，TSD） 轻柔刺激法和强迫运动法常用于大鼠、小鼠完全睡眠剥夺，近年用于研究氧化应激通路的运动模型常使用水平转台剥夺法，由Rechtschaffen等[22]于1983年首次应用。见表3。虽然果蝇不能表现出类似于哺乳动物睡眠时脑电图相关波形变化，但将果蝇置于旋转装置中，可以记录到20～30 Hz的局部场电位，睡眠状态下果蝇可表现出相应的电位变化[23]。

1.2.2 化学试剂刺激法 通过向大鼠体内注射特定化学试剂，使其体内发生相应变化，达到剥夺睡眠的目的。Lu等向大鼠下丘脑腹外侧视前区（Ventrolateral Preoptic Area，VLPO）注射鹅膏蕈氨酸，探究VLPO缺失对大鼠NREM及REM睡眠的影响[24];韦启志等[25]通过向大鼠腹腔注射氯苯丙氨酸，以探究化痰安神方治疗失眠症的药效学基础及其对失眠大鼠下丘脑食欲素表达影响。该方法在操作性和准确性上差异较大，重复性有待提高，从不同方面影响结果的可靠性。

1.2.3 生物钟基因修饰动物模型 基因修饰动物模型是现代生命科学研究的重要工具。per家族基因是生物钟调节的核心基因，1971年首次在果蝇中发现。该基因具有调节生物节律的作用，哺乳动物per家族基因包括per1、per2和per3。利用基因敲除小鼠生物钟模型发现，per1、per2、cry1和cry2这4个基因存在任意一个基因即可以维持昼夜节律。而在per1和per2双敲除小鼠模型中，仅per 3蛋白存在不足以维持昼夜节律[26]。利用基因修饰技术，Ins l果蝇连续繁衍60代后，可以稳定地表达出失眠性状。全基因组分析显示，果蝇差异表达基因主要参与代谢，神经元活动和感官知觉[27]。Ins-l果蝇模型在揭示睡眠机制及生物钟基因方面具有重要的意义。

1.2.4 中医睡眠剥夺模型的应用 睡眠剥夺模型常用于中医辨证治疗失眠症的研究中。例如肝郁化火證失眠大鼠模型、心肾不交失眠大鼠模型、阴虚血少证等大鼠失眠模型等。肝郁化火证是失眠的常见证型之一，研究常用慢性束缚法构建肝郁证大鼠模型。2018年何林熹等[28]人探索采用慢性束缚法（限制性制动）复合慢性疼痛刺激法（夹尾刺激）建立失眠的肝郁化火证大鼠模型，分析研究动物宏观表征和微观生物学指标。

2 小结

建立新型且模拟度更高的睡眠剥夺模型是决定实验能否成功的前提。本文主要展示了近年来睡眠剥夺研究动物模型的应用和构建的证据。目前中医对于失眠症的诊治，在模型的构建上缺乏客观统一的标准，常使用的睡眠剥夺模型与失眠症尚不能辨证统一，中药药效机制不明，同时缺乏有力的基础研究及大规模的随机双盲对照试验[29]。目前尚无可以完全选择性消除的睡眠剥夺模型，慢波睡眠功能尚不明确，干扰因素在所难免。设计新的药物或机械方法选择性地消除SWS可能是未来研究发展的方向。基于简单生物模型研究生物钟基因在昼夜节律和睡眠平衡2个过程中的作用及分子调节机制，将是未来研究的热点内容。

参考文献

[1]E.Murillo-Rodr guez，O.Arias-Carrion，K.Sanguino-Rodr guez，et al.Mechanisms of sleep-wake cycle modulation[J].CNS and Neurological Disorders—Drug Targets，2009，8（4）：245-253.

[2]QuickStats.Percentage of Adults Who Reported an Average of ≤6 Hours of Sleep per 24-Hour Period，by Sex and Age Group-United States，1985 and 2004[J].Morbidity & Mortality Weekly Report，2005，54（37）：933-933.

[3]Mullington J M，Haack M，Toth M，et al.Cardiovascular，Inflammatory，and Metabolic Consequences of Sleep Deprivation[J].Progress in Cardiovascular Diseases，2009，51（4）：294-302.

[4]Zhang S L，Bai L，Goel N，et al.Human and rat gut microbiome composition is maintained following sleep restriction[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2017，114（8）：E1564.

[5]江麗杰，何丽云，周雪忠，等.基于复杂网络的失眠中医诊治规律研究[J].中国中医基础医学杂志，2015，21（12）：1540-1543.

[6]Husse J，Eichele G，Oster H.Synchronization of the mammalian circadian timing system：Light can control peripheral clocks independently of the SCN clock[J].BioEssays，2015，37（10）：1119-1128.

[7]岳敏，杨禹，郭改丽，等.哺乳动物生物钟的遗传和表观遗传研究进展[J].遗传，2017，39（12）：1122-1137.

[8]Spoelstra K，Wikelski M，Daan S，et al.Natural selection against a circadian clock gene mutation in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（3）：686-691.

[9]Natan Pires G，Gomes Bezerra，Andréia，Tufik S，et al.Effects of experimental sleep deprivation on anxiety-like behavior in animal research：systematic review and meta-analysis[J].Neuroscience & Biobehavioral Reviews，2016，9（68）：575-589.

[10]Alexander A.Borbély，Neuhaus H U.Sleep-deprivation：Effects on sleep and EEG in the rat[J].Journal of Comparative Physiology，1979，133（1）：71-87.

[11]Nabaee E，Kesmati M，Shahriari A，et al.Cognitive and hippocampus biochemical changes following sleep deprivation in the adult male rat[J].Biomedicine & Pharmacotherapy，2018，104（8）：69-76.

[12]Ursin R.D1：Sleep in the Cat：A Parallel Increase of Deep Slow Wave Sleep and REM Sleep Following Total Sleep Deprivation[J].Acta Physiologica，2010，82（s1）：1A.

[13]Wu M F，John J，Maidment N，et al.Hypocretin release in normal and narcoleptic dogs after food and sleep deprivation，eating，and movement[J].AJP Regulatory Integrative and Comparative Physiology，2002，283（5）：1079-1086.

[14]Oleksenko A I，Mukhametov L M，Polyakova I G，et al.Unihemispheric sleep deprivation in bottlenose dolphins[J].Journal of Sleep Research，1992，1（1）：40-44.

[15]Seugnet L，Suzuki Y，Thimgan M，et al.Identifying Sleep Regulatory Genes Using a Drosophila Model of Insomnia[J].Journal of Neuroscience，2009，29（22）：7148-7157.

[16]Wang H.Circadian clock protein Period3 contributes to sleep homeostasis through histamine and GABA signaling in zebrafish[J].Mechanisms of Development，2017，145（8）：S22.

[17]Rattenborg N C，Martinez-Gonzalez D.Avian Versus Mammalian Sleep：the Fruits of Comparing Apples and Oranges[J].Current Sleep Medicine Reports，2015，1（1）：55-63.

[18]Martinezgonzalez D，Lesku J A，Rattenborg N C.Increased EEG spectral power density during sleep following short-term sleep deprivation in pigeons（Columba livia）：evidence for avian sleep homeostasis[J].Journal of Sleep Research，2010，17（2）：140-153.

[19]Ayala-Guerrero F，Mexicano G.Sleep and wakefulness in the green iguanid lizard（Iguana iguana）[J].Comparative Biochemistry and Physiology-Part A：Molecular & Integrative Physiology，2008，151（3）：305-312.

[20]Jr F W，Knight C P，Hartse K M，et al.Sleep and wakefulness in chelonian reptiles.I.The box turtle，Terrapene carolina[J].Archives Italiennes De Biologie，1974，112（3）：227-252.

[21]Cohen H B，Dement W C.Sleep：Changes in Threshold to Electroconvulsive Shock in Rats after Deprivation of ＼“Paradoxical＼” Phase[J].Science，1965，150（3701）：1318-1319.

[22]Reehtschaffen A，Gilliland M A，Bergmann B M，et al.Physiological Correlates of Prolonged Sleep Deprivation in Rats[J].Science，1983，221（4606）：182-184.

[23]Xiong，L.，Huang，X.J.，Song，P.X..The experiment of studymodel of Deficiency of yin Insomnia by Yangyin anshen koufuye[J].Chin J Pract Chin Mod Med，2005，18（8）：1187-1188.

[24]Lu J，Greco M A，Shiromani P，et al.Effect of Lesions of the Ventrolateral Preoptic Nucleus on NREM and REM Sleep[J].Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience，2000，20（10）：3830.

[25]韋启志，陈少玫，李世勇，等.化痰安神方治疗失眠症的药效学基础及其对失眠大鼠下丘脑食欲素表达影响的实验研究[J].中医药临床杂志，2017，29（7）：91-94.

[26]安怀杰，郑巍薇，史成和，等.生物钟基因period3的多态性及其与睡眠关系的研究进展[J].山西医科大学学报，2014，45（6）：525-528.

[27]Horovitch S J，Storti R V，Rich A，et al.Multiple actins in Drosophila melanogaster[J].Journal of Cell Biology，1979，82（1）：86-92.

[28]何林熹，诸毅晖，杨翠花，等.失眠肝郁化火证大鼠模型的建立及其评价[J].中华中医药杂志，2018，33（9）：156-160.

[29]魏砚君，卞宏生，叶晓楠，等.睡眠剥夺动物模型及其在中医药改善睡眠研究中的应用[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（10）：227-234.