真武汤治疗糖尿病肾病作用机制的网络药理学研究

布天杰 潘雨烟 张宁

摘要 目的：通過网络药理学方法探讨经方真武汤治疗糖尿病肾病（DKD）的核心作用靶标基因以及潜在通路机制，旨在指导临床用药同时为更深入的实验研究提供依据。方法：通过TCMSP数据库检索真武汤所含药物的有效成分、潜在作用靶点，在Genecards、OMIM、DisGeNET数据库筛选与糖尿病肾病有关的疾病靶点，借助Cytoscape3.7.2绘制并构建“药物-成分-靶点-疾病”可视化交互网络。利用STRING平台绘制关键靶点PPI网络，在David数据库里针对关键靶点蛋白开展GO基因功能、KEGG信号通路富集分析。结果：检索查筛出真武汤中有效活性成分59个、潜在靶点108个，其中涉及DKD的关键靶点47个，从蛋白互作网络中分析发现TNF、ATK1、JUN、RELA、IL6、MAPK8、CASP8、NOS2可能是真武汤治疗糖尿病肾病的核心靶点。GO富集分析得到180个条目，主要涉及细胞增殖、代谢、凋亡及脂肪细胞因子、葡萄糖稳态等。KEGG信号通路富集分析得到94条信号通路，主要涉及TNF信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路等。结论：本研究初步验证真武汤治疗糖尿病肾病的作用机制涉及多成分、多靶点、多信号通路，给予真武汤的临床应用及更深层次对糖尿病肾病的研究以一定理论依据。

关键词 真武汤;糖尿病肾病;网络药理学;作用机制

Network Pharmacology Study on Mechanism of Zhenwu Decoction in the Treatment of Diabetic Kidney Disease

BU Tianjie1，2， PAN Yuyan2， ZHANG Ning1

（1 Department of Nephrology and Endocrinology， Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100102， China; 2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：Through network pharmacology methods， the core target genes and potential pathway mechanisms of Jingfang Zhenwu Decoction in the treatment of diabetic nephropathy （DKD） are explored， aiming to guide clinical medication and provide basis for more in-depth experimental research. Methods：The active ingredients and potential targets of the drugs contained in Zhenwu Decoction were searched through the TCMSP database， and disease targets related to diabetic nephropathy were screened in the Genecards， OMIM， and DisGeNET databases. With the help of Cytoscape 3.7.2， the visualized interactive network of "drug-component-target-" was drawn and constructed. The STRING platform was used to draw the key target of PPI network， and carry out the GO gene function and KEGG signal pathway enrichment analysis for the key target protein in the David database. Results：A total of 59 effective active components combined with 108 potential targets were searched from Zhenwu Decoction， of which 47 key targets involved in DKD. TNF， ATK1， JUN， RELA， IL6， MAPK8， CASP8 and NOS2 may be the core targets of Zhenwu Decoction in the treatment of diabetic kidney disease. GO enrichment analysis yielded 180 entries， mainly involving cell proliferation， metabolism， apoptosis and adipocytokines， and glucose homeostasis. KEGG signaling pathway enrichment analysis resulted in 94 signaling pathways， mainly involving TNF signaling pathway， HIF-1 signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway and FoxO signaling pathway. Conclusion：The mechanism of Zhenwu Decoction in the treatment diabetic kidney disease involves multiple components， targets and pathways， aiming to give Zhenwu Decoction clinical application and deeper research on diabetic nephropathy with a certain theoretical basis.

Keywords Zhenwu Decoction; Diabetic kidney disease; Network pharmacology; Mechanism of action

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.001

糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）患者的常见并发症之一，在我国发病率呈逐年上升趋势。目前已超过了肾小球肾炎，成为慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）的首要病因[1]。糖尿病肾病以高血糖为特点，在糖脂代谢紊乱、炎性反应刺激及氧化应激等因素影响下，导致肾代谢功能降低[2]。临床上治疗糖尿病肾病的主要原则有维持血糖水平稳定、改善肾功能、纠正酸碱平衡及代谢紊乱。而现如今中医药的介入使得患者在进行基础西药治疗的同时对本病拥有进一步获取更好疗效的机会。

中医学并无糖尿病肾病的病名及相关记载，而根据其病因病机进行认识归纳，目前较为认可的是“肾消”或“消渴肾病”[3]。中医认为，DKD亦属消渴病范畴，系消渴气阴两虚日久，病变及肾，阴损及阳而导致的以“脾肾阳虚，湿毒内蕴”为基本病机的病证。真武汤出自古籍《伤寒论》，乃东汉医家张仲景治疗少阴阳气虚衰，气不化水，水湿泛滥而创立的经方。后世医者在掌握其“温补肾阳”的理论基础上将真武汤广泛应用于临床实践，在治疗糖尿病肾病中亦取得了良好的疗效[4-5]。

鑒于中药复方具有多成分、多靶点的特点，真武汤治疗DKD的作用机制尚未被明确阐明。而近年来网络药理学的兴起为医者提供全新的角度及思路，通过“基因靶点”及“信号通路”，以微观、精准的层次探索中药治疗有关疾病的作用机制。本研究采用网络药理学研究方法，以探讨真武汤治疗DKD的作用靶点及信号通路为目的展开研究。

1 资料与方法

1.1 真武汤有效活性成分及潜在靶点的筛选

真武汤由附子、茯苓、白术、生姜、芍药五味中药组合而成。使用TCMSP分别筛选出上述五味药物的所有化学成分[6]，根据药代动力学参数确定以口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18作为化学成分中有效活性成分的筛选条件[7]进行筛选，再剔除其中重复的化学成分以及没有靶点的化学成分。将得到的结果进一步搜索得到药物的潜在靶点。同时，借助靶点标准化数据库Uniprot（http：//www.uniprot.org/），对靶基因名称进行规范化校正[8]。

1.2 糖尿病肾病相关靶点检索与筛选

本研究利用人类基因组数据库Genecards、OMIM以及DisGeNET，以“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”作为关键词进行检索。对搜索到的结果进行汇总并剔除多余的重复项。在Genecards数据库检索过程中，为提高研究结果的准确性，本研究选取相关性分数（Relevance score）大于30分的靶点基因进行预测[9]。OMIM数据库作为基因和遗传表型以及它们之间关系的精确信息的主要储存库，包括基因图谱的基因组协调搜索、表型系列中表型遗传异质性的视图和临床概要的并排比较[10]。DisGeNET是一个整合和标准化多来源的疾病相关基因和变异数据的知识管理平台，涵盖了人类疾病的全谱以及正常和异常性状[11]。

1.3 真武汤治疗糖尿病肾病作用靶点的筛选及可视化网络构建

将真武汤有效活性成分的靶点与疾病的靶点进行匹配，利用OmicShare平台绘制韦恩图，将数据导入Cytoscape3.7.2，构建真武汤治疗糖肾的“药物-成分-靶点-疾病”可视化交互网络。将共有靶点导入String在线数据库中，限定物种为“Homo sapiens”，选取相互作用阈值高于0.9的高置信度数据，隐藏无蛋白互作关系的靶点，绘制出蛋白质间相互作用关系PPI网络图[12]。再将数据导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理及分析，以degree值和combined score值分析靶点之间相互的作用关系。

1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

借助David6.8在线数据库，对真武汤治疗糖尿病肾病的关键靶点开展GO及KEGG富集分析，探讨相关靶点在基因功能和信号通路中的作用[13]。以富集结果P值<0.05作为筛选条件从小到大进行排序，P<0.01被认为显著富集，筛选排名靠前的功能及通路，借助OmicShare平台进行数据可视化处理。

2 结果

2.1 真武汤有效活性成分及潜在靶点的筛选

在TCMSP数据库中检索真武汤组成药物附子、茯苓、白术、生姜和白芍的相关有效活性成分，依据上述筛选条件，结果依次得到有效活性成分21、15、7、5、13个。剔除重复项后，共得到59个有效活性成分，见表1及107个药物潜在靶点，见表2。

2.2 DKD相关靶点检索与筛选

在Genecards、OMIM、DisGeNET数据库检索DKD相关靶点，分别收集到659、517、560个基因，通过筛选并剔除重复，最终得到DKD相关靶点基因1 462个。

2.3 真武汤治疗DKD作用靶点的筛选及可视化网络构建

将筛选得到的DKD相关靶点与真武汤有效活性成分靶点映射筛选出共同靶点47个，见图1。通过Cytoscape3.7.2软件构建真武汤“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络，见图2。在图2中节点的颜色与形状区分各自意义，黄色节点表示药物的核心作用靶标，浅红色节点表示药物的有效活性成分，蓝V节点表示真武汤组成药物，浅蓝色圆形节点代表DKD。

将交叉共有的靶点基因导入STRING数据库，得到蛋白互作PPI网络图，见图3，再将数据导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理及分析，以degree值和combined score值分析靶点之间相互的作用关系。见图4。节点的颜色和形状大小代表degree值，蓝色越深，圆形越大，degree值越高;橘色越深，圆形越小，degree值越低。节点之间连线的粗细代表combined score值，线条越粗，互作分数越高;线条越细，互作分数越低。以此筛选出网络中信息传递效率更高、影响作用更大的核心蛋白质簇和核心靶点。结果显示TNF、ATK1、JUN、RELA、IL6、MAPK8、CASP8、NOS2为其核心靶点。

2.4 真武汤治疗DKD GO与KEGG通路富集分析

运用David将真武汤治疗DKD的靶标蛋白基因上传，开展GO功能富集分析，富集分析涉及其生物学过程、细胞组件及分子功能。结果共得到180个条目，以P<0.05作为筛选条件得到123个条目，其中显著富集P<0.01的有59个。主要涉及细胞增殖的正调节、细胞凋亡及RNA聚合酶转录的正调控等生物学过程，膜筏、细胞膜外间隙等细胞组件和蛋白激酶活性、细胞因子活性及葡萄糖稳态等分子功能。根据P值，将前30个条目借助OmicShare平台进行数据可视化处理，气泡图中气泡的大小代表该条目的基因数量，颜色代表富集显著性。见图5。

以相同方法进行KEGG通路富集分析共得到94条信号通路，P<0.05筛选出81条信号通路，其中显著富集P<0.01的有65条。主要涉及TNF信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、NF-κB信号通路等。以相同方法绘制气泡图。见图6。

3 讨论

中医学认为糖尿病肾病，系“消渴肾病”，是由消渴病误治、失治发展而来，消渴日久可耗气伤阴，累及脾肾虚损，肾无以主水，脾失健运，而致痰湿、瘀血、浊毒互结于肾之脉络，引起一系列相关症状。吕仁和教授在治疗DKD时指出，DKD在不同时期的病机处于持续变化的状态。初起以阴虚热结为主，日久气阴两虚，肾气不固而引发其他脏腑病变，脾肾阳虚证作为常见变证之一，治宜温阳益气，补肾健脾[14]。真武汤乃仲景方，出自《伤寒论》中，作为温阳利水方主治阳虚水泛证，为后世所推崇。方中附子为君，辛温大热，温肾阳而散寒;臣以茯苓、白术健脾益气，利水燥湿;佐生姜助附子温阳之力，又合白术、茯苓化湿利水;白芍可利尿养阴并调和附子燥烈之性。据临床研究表明，真武汤可以显著改善DKD患者临床症状并改善肾功能[4-5]。

现代医学研究表明，DKD的病理学特征主要以肾小球肥大，基底膜增厚，系膜基质增生，肾间质纤维化及肾动脉硬化等为主[15]。DKD的发病机制较为复杂，除遗传因素外包括糖代谢异常、肾脏血流动力学变化、脂代谢紊乱、细胞因子参与、高糖诱导的氧化应激反应以及自噬作用等。根据现代药理学研究，附子中含有附子多糖，有通过促进GLUT4转位而增加3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞对葡萄糖消耗的功能[16];白术多糖能够增强外周靶器官对胰岛素的敏感性从而改善血糖水平[17];茯苓多糖一方面可以利水消肿，另一方面也可以抑制肾脏细胞凋亡保护肾脏[18];生姜中姜黄素可降低DKD小鼠尿蛋白、改善肾小球硬化，降低肾脏炎性反应水平[19];白芍总苷能够抑制炎性因子，保护足细胞，改善蛋白尿症状，延缓DKD的病情进展[20]。

本研究结果显示，真武汤共含有59个有效活性成分，主要包括芍药苷、水黄皮素、谷甾醇、山柰酚等。芍药苷（Paeoniflorin）是白芍总苷中的主要生物活性成分。有研究表明，芍药苷可通过抑制高糖环境下巨噬细胞的活化，减少TNF-α、IL-1β、MCP-1及巨噬细胞活化标志物iNOS等炎性因子的产生，发挥抗炎、抗氧化的作用，从而改善肾脏炎性状态达到保护肾脏的目的[21]。相关动物实验证实芍药苷可减少DKD大鼠尿蛋白，抑制肾小球肥大，改善肾脏炎性水平[22]。附子中的水黄皮素（Karanjin）是一种黄酮类化合物，具有降血糖、胃保护以及抗菌作用[23]，且在大鼠中具有良好的耐受性[24]。谷甾醇（Sitosterol）作為一种附子与生姜共同含有的甾体化合物，具有抗高血糖活性。其降糖作用可能是通过刺激胰岛存活的β细胞导致更多的胰岛素释放[25]。Rangachari等[26]发现，谷甾醇通过增加胰岛素分泌并抑制糖异生改善血糖水平，DKD大鼠经口给予γ-谷甾醇后血糖和糖化血红蛋白显著降低，血浆胰岛素水平明显升高。另有研究表明，β-谷甾醇可通过激活2型糖尿病大鼠脂肪组织中的IR和GLUT4来改善血糖控制[27]。白芍中的山柰酚（Kaempferol）对应靶点最多，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化的作用，并能够抑制高糖环境下肾系膜细胞的增殖从而保护肾脏[28]。

根据蛋白互作网络分析，TNF、ATK1、JUN、RELA、IL6、MAPK8、CASP8、NOS2等是真武汤治疗DKD的核心靶点。TNF具有广泛的生物学活性，体现于TNF-α的双重生物学效应中。当浓度较低时TNF-α具有抗感染的作用，能够参与调节炎性反应及组织修复;当其浓度过高则可破坏免疫平衡，对机体产生病理损伤。研究表明[29-30]，高糖环境可刺激肾脏多种细胞释放TNF-α，其进一步刺激系膜细胞产生氧自由基，过程中产生的大量的脂质代谢产物作用于细胞内膜和基底膜，引起局部微血管通透性增强而损伤肾小球，促进蛋白尿的产生。JUN是AP-1家族转录因子的成员之一，通过与靶基因启动子中的TRE元件结合活化下游核转录因子激活转录，介导应激状态下的细胞改变[31]。相关研究发现[32-33]，在DKD持续高糖的状况下，转化生长因子β1（TGFβ1）可被活性氧簇ROS激活，其过度表达导致细胞外基质（ECM）沉积以及肾小球硬化，最终导致肾纤维化的发生。而c-Jun能够通过自动调节和磷酸化作用，与TGF-β1启动子上的特定位点结合，促进其转录表达从而加快肾脏纤维化的发生。动物实验证实[34]，抑制c-Jun的表达可明显改善DKD大鼠的肾脏损伤状况。RELA是NF-κB家族的重要成员，通过调控下游靶基因转录参与细胞多种生命活动[35]。最新的证据表明[36-37]，RELA一方面可以通过蛋白质磷酸化调节激活转录因子增加TNF-α、IL6等炎性因子的释放增强炎性反应;另一方面在系膜细胞中RELA通过乙酰化激活NF-κB信号通路，下调LC3-II从而抑制高血糖诱导的足细胞自噬，导致肾脏细胞炎性反应加剧和线粒体功能障碍，进一步损伤肾脏功能和形态。以上结论充分表明真武汤通过多分子、多靶点的模式有效治疗DKD。

GO功能富集分析結果表示细胞凋亡、细胞增殖的调控、细胞膜外间隙、外源性凋亡信号通路、RNA聚合酶启动子转录的正调控等生物过程与真武汤治疗DKD存在密切联系。KEGG通路富集分析结果显示，真武汤治疗DKD主要涉及TNF、Toll样受体、HIF-1、FoxO、NF-κB等多条信号通路。TNF信号通路主要参与细胞生长、分化、凋亡、炎性反应诱发及免疫调节等生物学效应。TNF-α的过度分泌可刺激促炎细胞因子MCP-1和瘦素的增加，从而引起胰岛素抵抗;另外，TNF-α能够诱导蛋白激酶C（PKC）的活化，激活NADPH氧化酶，诱导产生ROS，促进氧化应激过程从而加速损伤肾脏[38]。Navarro JF等[39]研究发现，TNF-α拮抗药可有效减少肾皮质中的TNF-α mRNA表达，从而明显改善肾脏炎性状态并降低蛋白尿。马俊杰等[40]发现，真武汤能够降低大鼠血清TNF-α水平缓解其肾脏炎性反应。Toll样受体作为模式识别受体之一，参与调节机体免疫炎性反应，并发挥重要作用。TLR2/4主要表达于肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞中，高糖环境促进TLR2/4 mRNA表达，通过介导下游MyD88蛋白表达激活NF-κB增加炎性反应因子的转录;或直接激活免疫细胞及肾脏实质细胞，持续分泌大量炎性递质、细胞因子加剧肾脏炎性反应，加速肾小球硬化[41]。研究证实[42]，真武汤可有效降低心肾阳虚证大鼠TLR2/TLR4蛋白在肾脏组织中的表达，减缓肾脏病变。低氧诱导因子（Hypoxia Inducible Factor，HIF）通过特异性调节某些基因、蛋白的表达使细胞适应低氧状态。HIF-1能够与低氧反应元件结合，激活低氧靶基因转录从而影响组织生长发育及应激反应[43]。在高糖环境中，组织处于持续缺氧状态，肾脏组织应激性提高HIF-1的表达。HIF-1通过调节线粒体呼吸使局部组织ROS水平及细胞凋亡增加，促进缺氧适应性的产生从而降低组织在缺氧状态下的损伤，以达到保护肾脏细胞的目的[44-45]。孙静等[46]发现，真武汤能够上调HIF-1α的表达，减轻肾小管上皮细胞的氧化损伤，减缓肾脏纤维化的过程。

本研究借助网络药理学研究方法，探讨真武汤治疗DKD的潜在作用机制，结果表明其涉及多成分、多靶点、多通路，是通过多途径系统协同来发挥作用。然而，由于中药组方中君臣佐使间配伍的复杂性，单纯从以大数据、生物信息技术为基础的网络药理学研究阐述其作用机制稍显单薄。本研究旨在预测探讨真武汤治疗DKD的作用靶点及通路，为进一步明确真武汤治疗DKD的作用机制提供了科学的依据。通过本研究筛选得到的基因靶点及真武汤通过调节免疫、炎性反应及低氧诱导等信号通路治疗DKD的作用机制仍需进一步的实验验证，为其基础和临床应用提供理论依据。

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（2020-05-27收稿 责任编辑：徐颖）

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81973801）;首都卫生发展科研基金重点攻关项目（首发2018-1-4161）作者简介：布天杰（1995.08—），男，硕士研究生，研究方向：中医药防治肾病内分泌疾病，E-mail：tmacbu@163.com通信作者：张宁（1963.09—），女，医学博士，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中医药防治肾病内分泌疾病，Tel：（010）84739029，E-mail：znice3927@126.com