高效液相色谱法同时测定大黄中没食子酸和肉桂酸的含量

张乾旭 刘国亮 张乾毅

（1 广州中医药大学附属第二医院 广东 广州 510120）

（2 中山大学附属肿瘤防治中心 广东 广州 510060）

大黄有唐古特大黄、正品大黄和药用大黄的根茎及干燥根[1]。大黄适宜内服外用，能攻守、能止血、能通阻、能解毒[2]。大黄在加热蒸炒炮制的过程中，成分含量变化很大，药效随之发生变化[3]。中药炮制前后药性改变，其化学成分含量增减变化[4]。目前大黄在临床上主要用于治疗急腹症等疾病，该方剂在辅助改善脑血管病人意识等方面也有很好的疗效[5]。据研究表明，大黄具有止血作用的主要药效成分是鞣质中含的没食子酸和儿茶素[6]；研究者等以往的研究多数以对大黄及其大黄炮制品前后蒽醌类的成分含量差异指标居多[7]，而对鞣质类成分含量差异比较这方面的研究居少。本研究采用HPLC 法建立中药大黄没食子酸、肉桂酸成分的含量测定方法，为其质量评价标准研究提供试验依据。

1.仪器与试药

1.1 仪器

2695 型高效液相色谱仪(美国沃特世公司）；1780 型紫外分光光度计(岛津仪器（苏州）有限公司)；电子分析天平(赛多利斯科学仪器（北京)有限公司)。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，美国Fisher 科学世界公司）；甲醇、乙醇、磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸（批号：180921，上海融禾医药科技有限公司）；肉桂酸（批号：20181125，宝鸡市晨光生物科技有限公司），纯度＞98%。

2.方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱选择：Thermo SCIENTIFIC Hypersil GOLD Dim.(mm)(4.6mm×250mm，5μm)流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液，依照表1 进行梯度洗脱，检测波长278nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量为10μl，按照上述条件各组分离分离度良好，见图1。

表1 梯度洗脱表

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸对照品6.25mg，肉桂酸3.82mg 置于10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，即得各对照品储备液。再分别精密器量取上述没食子酸对照品储备液1ml，肉桂酸对照品储备液0.5ml 于10ml 容量瓶中，摇匀，加甲醇稀释定容到刻度，即没食子酸浓度62.50ug/ml，肉桂酸浓度19.10ug/ml。

2.1.3 大黄样品制备 精密称取中药大黄粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入20ml65%甲醇，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用65%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，滤过，取续滤液，即得。

3.方法学考察

3.1 线性关系考察

精密吸取大黄混合对照品溶液2ul、5ul、8ul、10ul、12ul、15ul、20ul 分别注入高效液相色谱仪，各进样1 次，测定相应条件下的峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量(ug)为横坐标，制得标准曲线并计算相对应的回归方程。各组分在各自的含量范围内线性关系良好，结果见表2。

表2 大黄不同炮制品的线性方程及线性范围

3.2 精密度试验

精密称取大黄粉末0.5g，按“2.1.1”项下的色谱条件以及流动相条件进样，记录各自的峰面积，连续进行6 次，并计算没食子酸、肉桂酸峰面积的RSD。结果测得混合对照品中没食子酸、肉桂酸面积的RSD 值分别为1.28%、和0.62%，RSD 都小于3.0%，表明所用液相色谱仪的精密度较好。

3.3 稳定性试验

精密称定大黄粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，按“2.1.3 大黄样品制备成样品溶液”项下的方法，分别于在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.1”项下的色谱条件进样，测定各样品的峰面积，结果测得没食子酸、肉桂酸峰面积的RSD 分别为2.08%、1.62%。2 种成分的RSD 值小于3.0%，说明样品在24h 内保持良好的稳定性。

3.4 重复性试验

精密称取大黄不同炮制品药材粉末0.5g，每种炮制品均称取6 份，按“2.1.3 大黄样品制备成样品溶液”项下的方法，按“2.1.1”项下的色谱条件进样，测定各样品的峰面积，结果测得没食子酸和肉桂酸的含量分别为3.8962mg/g、0.7482mg/g；结果测得没食子酸和肉桂酸的RSD 分别为1.82%、2.26%，其RSD 值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

3.5 加样回收率试验

精密称取大黄药材粉末025g，精密称定9 份，分成低、中、高加样组，每组分别加入混合对照品溶液，按“2.1.3 大黄样品制备成样品溶液”项下的方法，按“2.1.1”项下的色谱条件进样，计算大黄低、中、高加样组中的没食子酸和肉桂酸的平均回收率和其RSD 值，结果见表3，表明该方法准确性良好。

表3 大黄加样试验数据（n=9）

4.样品含量测定

分别精密称定大黄药材粉末0.5g，共3 份，按“2.1.3 大黄样品制备成样品溶液”项下的方法，按“2.1.1”项下的色谱条件进样，通过外标一点法计算没食子酸和肉桂酸的含量，结果见表4。

表4 大黄含量测定数据

5.讨论与总结

采用二极管阵列检测器，在200 ～400nm 波长下对样品和混合对照品溶液进行全波长扫描，混合对照品没食子酸和肉桂酸在278nm 波长下共有最佳吸光度，且溶剂峰小，基线平稳，混合对照品的响应值较大，故最终采用278nm 作为本试验的检测波长。

本实验采用甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液、甲醇-0.3%冰醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等流动相选择试验比较，认为以甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相，梯度洗脱，大黄没食子酸、肉桂酸分离效果较好，与杂峰达到基线分离。在样品制备方法考察中，选择水、甲醇（30%、40%、50%、60%、65%、70%和75%）做对比，当以65%甲醇做溶剂时提取的样品中肉桂酸和没食子酸的含量相对较高，因此选用65%甲醇作为最优提取溶剂的体积分数。