衣康酸对脓毒症小鼠急性肾损伤的保护作用

焦志华 步莉娜 陈军 邹锋 欧阳元明

[摘要] 目的 观察脓毒症急性肾损伤小鼠肾组织炎性因子的变化规律并探讨衣康酸对脓毒症小鼠炎性因子的影响以及对脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肾损伤的保护作用。 方法 雄性C57BL/6小鼠24只，根据随机数字表法将其分为三组：空白对照组、LPS组、衣康酸+LPS组，每组各8只。衣康酸+LPS组腹腔给予50 mg/kg衣康酸，空白对照组和LPS组腹腔给予等量生理盐水。给药2 h后，空白对照组注射等量的生理盐水，其他两组小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）。24 h后，麻醉小鼠，留取肾组织备用。肾组织切片苏木精-伊红染色观察肾损伤程度。酶联免疫吸附试验法检测血浆中白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的变化。Western blot法检测肾组织中细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38和P65蛋白的磷酸化程度。結果 LPS处理24 h后，LPS组肾损伤评分，髓过氧化物酶活性，血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，肾组织中ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），而衣康酸+LPS组低于LPS组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 衣康酸对LPS诱导的急性肾损伤有保护作用，可能是抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路介导的炎性反应。

[关键词] 衣康酸;急性肾损伤;丝裂原活化蛋白激酶信号通路;炎性反应

[中图分类号] R36;R392;R91          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（a）-0022-05

The protective effect of Itaconic Acid on acute renal injury in sepsis mice

JIAO Zhihua   BU Li′na   CHEN Jun   ZOU Feng   OUYANG Yuanming

East Hospital， Shanghai Sixth People′s Hospital， Shanghai Health Medical College， Shanghai   201306， China

[Abstract] Objective To observe the changes of inflammatory factors in renal tissue of sepsis mice with acute kidney injury and to investigate the effect of Itaconic Acid on inflammatory factors in sepsis mice and the protective effect on lipopolysaccharide （LPS） induced acute kidney injury in mice. Methods A total of 24 male C57BL/6 mice were divided into three groups： blank control group， LPS group， and Ttaconic Acid + LPS group， with 8 mice in each group. A total of 50 mg/kg of Itaconic Acid was given to the abdominal cavity of the Itaconic Acid + LPS group， and the same amount of normal saline was given to the abdominal cavity of the blank control group and the LPS group. After 2 h of administration， the mice in the blank control group were injected with the same amount of normal saline， and the mice in the other two groups were intraperitoneally injected with LPS （10 mg/kg）. After 24 h， the mice were anesthetized and kidney tissue was taken for reserve. Renal tissue sections were stained with hematoxylin-eosin to observe the degree of renal injury. Serum levels of interleukin （IL） -1， IL-6 and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were determined by enzyme linked immunosorbent assay. Phosphorylation levels of extracellular regulatory protein kinase （ERK）， c-Jun amino-terminal kinase （JNK）， P38 and P65 proteins in renal tissues were detected by Western blot. Results The renal injury score， MPO activity， the levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α in the plasma， the levels of ERK， JNK， P38 and P65 protein phosphorylated in the renal tissue of LPS group were higher than those of the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. While those of Itaconic Acid + LPS group were lower than LPS group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Itaconic Acid has a protective effect on LPS-induced acute kidney injury， possibly by inhibiting the inflammatory response mediated by the mitogen-activated protein kinase signal pathway.

[Key words] Itaconic Acid; Acute kidney injury; Mitogen-activated protein kinase signal pathway; Inflammatory response

严重脓毒症是导致约50%重症患者发生急性肾损伤（AKI）的主要原因[1-2]。即使是感染较轻的患者，AKI的发病率也高达16%～25%。根据严重程度，由脓毒症引起的AKI的死亡率高达50%～60%[3-4]。脓毒症AKI的特点是肾脏过滤血液和清除氮废物的能力迅速下降，通常在脓毒症发作后数小时至数天内发生变化[5]。对病理生理机制的了解有限，阻碍了对脓毒症引起的AKI的有效治疗的发展[6]。然而，早期感染源控制和支持性護理，使用血管升压药、静脉输液和肾脏替代治疗（RRT）似乎是合理的，但对脓毒性AKI患者并不能产生有利的治疗效果[7]。炎性反应在AKI的出现、加重和预后中起关键作用，包括内皮细胞和肾小管细胞释放炎症介质，炎症细胞浸润，以及有毒分子对肾小管的破坏作用[8]。

巨噬细胞在炎性反应过程中产生大量的衣康酸，该物质最近被称为免疫调节代谢物[9]。此外，研究显示[10]衣康酸及其衍生物可以抑制炎性反应，减轻组织损伤。然而，其在AKI中的作用及具体的分子机制尚未阐明。

急性肾损伤的发病机制尚不明确，但炎性反应扮演了重要的角色，本研究目的在于探讨脂多糖（LPS）诱导的AKI模型中衣康酸的作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物

24只SPF级C57BL/6小鼠，雄性，7周龄左右，体重19 g左右，购自上海交通大学附属医学院，动物合格证号：SCXK（沪）2018-0007。动物伦理由上海交通大学附属医学院伦理委员会批准，符合相关规定。购买后小鼠于控制条件下饲养，自由进食标准饲料和水。严格根据国家《实验动物管理条例》进行动物实验。

1.2 主要试剂和抗体

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒购于Invitrogen公司（生产批号分别为：BMS607-3、BMS6002、KMC0061）;髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒购于Abcam公司（生产批号：ab105136）。

细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、P38、p-P38、P65、p-P65抗体购买于Cell Signaling Technology（Danvers，MA）公司（生产批号分别为：4695T、4370T、9252T、4668T、9212S、4511T、8242T、3031S）;衣康酸购自Merk Millipore（Germany）公司（生产批号：J29204）。

1.3 实验小鼠分组和处理

SPF级雄性C57BL/6小鼠共24只，根据随机数字表法分为3组：空白对照组、LPS组、衣康酸+LPS组，每组各8只。衣康酸+LPS组腹腔注射衣康酸（50 mg/kg）[11]，空白对照组和LPS组腹腔给予等量生理盐水;给药2 h后，空白对照组注射等量生理盐水，其他两组腹腔注射LPS（10 mg/kg）[12]。24 h后，将小鼠麻醉，用生理盐水进行心脏灌注后，将右肾取下并放入液氮速冻，再放入-80℃冰箱保存，为后续分子生物学检查做准备;左肾用10%甲醛固定24～48 h，送病理科进行镜检[13-14]。

1.4 肾组织病理学苏木精-伊红（HE）染色检测

小鼠左肾取材后，用10%的甲醛将肾组织浸泡24～48 h，随后将处理好的左肾进行石蜡包埋，用切片机切片（厚度为4 μm）。切片后进行HE染色，并在光学显微镜下观察肾组织形态学改变[15]。肾组织病理切片出现管状上皮增生、刷状缘消失、空泡化、肾小管扩张及破裂、细胞溶解和细胞坏死，证实急性肾损伤动物模型造模成功[16]。

1.5 肾损伤评分

每高倍镜视野随机选择10个有病变的肾小管，按100个肾小管记分，由上海市第六人民医院东院2名病理科医生在双盲的情况下单独进行评分。评分标准参照既往文献[17]（肾小管损伤定义为：管状上皮增生，刷状缘消失，空泡变性，管型形成，及上皮脱落。0分：正常形态;1分：肾小管受损面积≤25%;2分：肾小管受损面积>25%～50%;3分：肾小管受损面积 >50%～75%;4分：肾小管受损面积>75%～100%。

1.6 ELISA法检测血浆中炎性因子的变化

按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒说明书完成以下步骤：①标准品的稀释与加样;②加样;③温育;④配液;⑤洗涤;⑥加酶;⑦温育、洗涤;⑧显色;⑨终止;⑩测定并计算。加入终止液混匀后即刻测量光密度（OD值）450 nm（3 min内）。每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值，手工绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

1.7 肾组织MPO活性的检测

将小鼠肾组织加入生理盐水制成10%的组织匀浆，离心后取上清液，按照MPO检测试剂盒说明书的说明和步骤进行检测，打开分光光度计在460 nm处读取OD值，记录各管OD值。

MPO活性计算公式：MPO活性（U/g）=（测定管OD值-对照管OD值）/（11.3×取样量g）。

1.8 Western blot检测蛋白含量

组织裂解后，使用BCA法进行总蛋白定量，调整蛋白浓度至10 μg/μL，-20℃保存。蛋白上样量 为15～30 μg，10%～12%的分离胶电泳后，利用电转膜仪转膜，转膜条件为恒流250 mA，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。随后进行封闭：5%的脱脂牛奶室温封闭2 h。一抗封膜后室温下摇1 h然后放入4℃冰箱过夜，二抗室温孵育1 h。按照1∶1的比例混匀ECL显影液，均匀滴在PVDF膜上，静置30 s显影。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，并进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织HE染色

空白对照组肾间质和皮质未见炎症细胞浸润，未见肾小管上皮细胞病理改变。LPS组和衣康酸+LPS组可见肾皮质和间质出现炎症细胞浸润，大部分肾小管上皮细胞出现肿胀，空泡变性，但衣康酸+LPS组病理学改变较LPS组轻。LPS组肾损伤评分高于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;衣康酸+LPS组肾损伤评分高于空白对照组，但低于LPS组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 三组肾组织MPO活性及血浆炎性因子比较

LPS组MPO活性及血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;衣康酸+LPS组MPO活性及血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于LPS组，差异有统计学意义（P < 0.05）;衣康酸+LPS组MPO活性、TNF-α及IL-6高于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但两组IL-1β比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 Western blot检测三组肾组织中ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平

LPS组ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平高于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;衣康酸+LPS组ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平低于LPS组，差异有统计学意义（P < 0.05）;衣康酸+LPS组与空白对照组比较，ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

3 讨论

在不同的致病因素中，不同类型AKI的机制可能不同，但炎症、凋亡和氧化应激参与了缺血再灌注损伤和LPS诱导的AKI[18]。LPS常被用于脓毒症导致AKI的机制研究，在动物模型中可引起强烈的炎性反应和氧化应激[19]。

AKI的体内和体外模型中已经证实核因子-κB （NF -κB）激活[8，20]。越来越多的研究显示[21]，NF-κB在AKI相关炎症和其他细胞的事件中扮演关键的角色。LPS刺激肾小管上皮细胞产生炎症介质、自由基和其他破坏因子;NF-κB激活后表达多种促炎细胞因子;最终导致肾功能不全[22]。既往有研究报道[23-24]，通过降低炎性反应的强度，AKI动物模型的肾损伤可以得到明显的改善，因此，有效地清除炎症介质，包括TNF-α、IL-15和IL-6，是治疗败血症性AKI的有效手段。

本研究也观察到腎组织中LPS引起的急性肾损伤、肾组织炎性因子的升高;肾组织ERK、P38和JNK蛋白的磷酸化水平升高以及NF-κB激活。腹腔预先给予衣康酸能显著降低LPS引起的急性肾损伤、肾组织炎性因子的升高;降低肾组织ERK、P38和JNK蛋白的磷酸化水平以及NF-κB激活。

基于本研究，笔者认为衣康酸在LPS引起的AKI中发挥重要保护作用。另外，应该更深入的探讨衣康酸在AKI中的作用，考虑将衣康酸作为抑制AKI的治疗药物。

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（收稿日期：2020-02-06  本文編辑：刘永巧）