高效液相色谱法测定美洛昔康注射液中美洛昔康的含量

张浩然 张亦菲 徐 汀 田 恺 华贤辉 黄家莺*

（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

美洛昔康属于烯醇酰胺类非甾体抗炎药，最早由勃林格殷格翰公司研制[1]。研究表明，美洛昔康对环氧化酶-2（COX-2）有选择性抑制作用，解热镇痛及抗炎性作用较高，对胃肠道、肾脏副作用较低[2]，主要用于风湿关节炎[3]、骨关节炎的治疗[4]及术后止痛[5]。目前，对于美洛昔康的测定，主要有电化学法[6]和紫外分光光度法[7]，这两种方法虽有一定的准确性，但难以适应大批量检测。而液相色谱法较多报道于血清中美洛昔康的检测[8-9]，且条件繁琐。本文根据注射液的特点，建立了高效液相色谱法测定美洛昔康注射液中美洛昔康的含量，该方法简单快速，具有良好的精密度和准确度，能够满足质量控制需求。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪：Agilent 1100，安捷伦科技有限公司，Waters e2695，沃特世公司；电子天平：感量0.01 mg，AB265-S，梅特勒- 托利多仪器（上海）有限公司；纯水机：Molatom 1810A，中国重庆摩尔水处理设备有限公司。

1.2 试药

美洛昔康对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100679-201102，含量99.9%）；实验用水（电阻率>18 MΩ·cm，符合GB/T6682 一级用水的规定）；醋酸铵（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；甲醇（色谱纯）；美洛昔康注射液（鲁舍里乐药业有限公司提供，批号1801001、1801002 及1805003）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ODSC18色谱柱（柱长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm），以甲醇-0.lmol/L 醋酸铵溶液（1:1）为流动相流动相；流速为1 mL/min；进样量为20 μL；检测波长为270 nm。典型色谱图见图1。

图1 美洛昔康对照品的典型色谱图

表1 准确度试验结果（n=9）

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备。精密量取本品适量，于容量瓶中，加流动相定量稀释制成每1ml 中约含美洛昔康0.1mg 的溶液，摇匀，经0.22 μm 滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照品储备溶液的制备。取美洛昔康对照品50 mg，置50 mL 量瓶中，加1 mol/L 氢氧化钠溶液4 mL，充分振摇3分钟，加甲醇30 mL，涡旋3 分钟，超声处理10 分钟，放冷。用50%甲醇溶液（V1∶V2）稀至刻度，摇匀，得到对照品储备溶液。

2.2.3 对照品工作溶液。精密量取1 mL 对照品储备溶液置10 mL 容量瓶中，加流动相定量稀释制成每1ml 中约含美洛昔康0.1mg 的溶液，摇匀，经0.22 μm 滤膜滤过，滤液作为对照品工作溶液。

2.3 供试品的测定

按照2.1 的色谱条件及2.2 的溶液制备方法，将供试品溶液和对照品工作溶液注入高效液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，即得美洛昔康的含量。

2.4 线性关系考察

美洛昔康对照品储备液经精密稀释，制备60、80、100、120、160 μg/mL 的美洛昔康对照品系列溶液，每个浓度点重复5 次进样，按照2.1 的色谱条件进行测定。以美洛昔康对照品浓度为横坐标（x），以相应浓度测得的峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。得到方程为y=31361x+31140，相关系数为0.9999。说明美洛昔康浓度在60～160 μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 准确度试验

随机选取样品，按照对照品添加量与待测成分量之比为0.8:1, 1:1, 1.2:1 进行低、中、高三种不同浓度的准确度试验，每个浓度3 份平行，按照2.1 的色谱条件及2.2 的制备方法进行测定。平均回收率为97.4%，RSD 为0.9%，结果见表1。

2.6 重复性试验

按照2.1 的色谱条件及2.2 的制备方法，对各批次样品重复进样6次，并记录峰面积，进行重复性试验。结果表明（表2），各批次样品的RSD为0.23%～0.25%，重复性较好。

2.7 中间精密度试验

在不同时间，由不同的实验人员用不同的仪器对相同样品进行中间精密度试验。条件A：实验员甲，使用Agilent 1100 高效液相色谱仪，配Shiseido MG 色谱柱（C18，柱长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm）；条件B：实验员乙，使用Waters e2695 高效液相色谱仪，配Waters Symmetry 色谱柱（C18，柱长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm）。选择各批次样品，按照上述A、B 不同条件进行试验。结果表明（表3），RSD 为0.19%～0.62%，中间精密度较好。

2.8 耐用性试验

选取1801003 批次样品，按照2.1的色谱条件及2.2 的制备方法配置3份平行样品，进行耐用性试验，考察流速及柱温对含量测定的影响。结果表明（见表4），流速在0.8～1.2 范围内对含量测定结果无影响；柱温在35℃～45℃范围内对含量测定结果无影响。

2.9 供试品测定

采用本法，对供试品的含量进行测定，并与生产企业提供的数据进行比较，结果见表5。结果表明，本方法测定美洛昔康注射液含量结果与生产企业提供的检测结果基本一致。

3 讨论与结论

3.1 检测波长的确定

将美洛昔康对照品储备液用流动相稀释10 倍后，利用二极管阵列检测器在190 nm～400 nm 范围内对美洛昔康进行了紫外波长扫描，发现其在270 nm 处有最大吸收，故确定270 nm为美洛昔康含量测定的检测波长。

3.2 对照品的预处理

据报道，二甲基甲酰胺可用于溶解美洛昔康对照品[10]。二甲基甲酰胺作为助溶剂，对改善色谱峰型，平稳基线有一定作用，但长期使用会引起许多问题。首先，二甲基甲酰胺可引起人体消化道紊乱，肝脏和肾脏损害，长期接触，会损害试验人员的身体健康[11]。其次，二甲基甲酰胺作为一种特殊的溶剂，会对色谱柱造成损伤[12]，进而降低色谱柱的柱效及理论塔板数，不利于检测任务的长期重复进行。本文采用甲醇超声助溶，并用50%甲醇定容稀释，对美洛昔康的溶解效果好。在保证方法稳定可靠的同时，将试验对人员健康和色谱柱的潜在危害降至最低。

表2 重复性试验数据表（n=6）

表3 中间精密度试验数据表（n=12）

表4 耐用性试验数据表（n=3）

本方法简便快捷，具有较好的准确度及精密度，能够满足对美洛昔康注射液质量控制的需求。

表5 含量测定试验数据表（n=3）

% % 1801001 1801002 1801003 106.30.18100.60.15106.00.27106.60.16100.40.19105.70.23-0.30.20.3

[8]谭力,张杰,杨丽莉,凌树森,熊守军.美洛昔康血药浓度高效液相色谱法测定及生物等效性研究[J].中国药科大学学报,2000(4):31-34.

[9]李英,王高峰,武银芳,龙丽红.人血浆中美洛昔康的高效液相色谱测定法[J].药物分析杂志,2001(1):33-36.

[10]贾宝秀,曹明亮,李珂等.HPLC 法测定美洛昔康胶囊的含量[J].泰山医学院学报,2006(2):97-98.

[11]田丙正,张敏,张付海等.液相色谱法测定工业废水中N,N-二甲基甲酰胺[J].工业水处理,2018,38(2):89-91.

[12]刘翻,熊志超,张凌怡等.高效液相色谱柱清洗与再生方法[J].分析测试技术与仪器,2010,16(2):71-77.