玉屏风水煎剂及其组分对大鼠肾脏组织及HEK-293 细胞OAT1／3 表达的影响

闻泽强 李大朗 宋 珏

（安徽医科大学 药学院， 安徽 合肥230032）

复方玉屏风 出自宋代医家张松的《究原方》，全方由黄芪、白术、防风3 味中药组成，其主要作用为益气固表止汗、增强免疫［1］。现多用于治疗变应性鼻炎、上呼吸道感染等因表虚不固而染风邪的患者，及支气管哮喘、慢性荨麻疹等因感染风邪而至病况反复发作的患者，甚至用于治疗因伤风感冒而诱致肾小球肾炎病况反复的患者［2-3］。

OATs 属于溶质载体超家族SLC22，主要是分布在肾小管上皮细胞基底膜侧的转运蛋白，有机阴离子（OAs） 可以通过其转运功能被近端小管上皮细胞从血液中吸收［4-5］。OATs 转运功能是肾脏排泄机制中非常重要的一步，许多种药物都是通过OATs 蛋白经肾脏排泄［6-7］。在这一排泄过程中，药物可能因为OATs 表达量或活性受到改变而蓄积在体内或者使其排泄加快，从而改变疗效和毒副作用；抑或是几种药物相互竞争OATs 而发生药物之间的拮抗作用影响机体［8-9］。本课题前期实验［10］表明，玉屏风水煎剂中某些组分可能通过抑制黄芪甲苷的排泄，而使其相较于黄芪水煎剂有更好的抗炎免疫作用。因此本实验通过大鼠及HEK-293 细胞探讨玉屏风及其组分对OAT1／3 基因及蛋白表达的影响。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠，雄性，普通级，体质量（225±30） g，购自安徽医科大学动物中心，动物使用许可证号SYXK（皖） 2017-006。所有的动物均处在稳定舒适的环境中生存，室温控制在25℃左右，相对湿度维持在40%～60%，光照周期12 h／12 h，进食及饮水自由，饲养1 周后用于实验。动物实验的福利要求均符合相关的实验动物管理条例和实验动物伦理的要求。

1.2 细胞株 HEK-293 细胞（货号SE0059，ACTT 细胞库） 购自武汉塞维尔生物科技有限公司，具有稳定表达OAT1／3 蛋白的功能，用含10%胎牛血清的MEM 培养基培养。

1.3 药物与试剂黄芪饮片Astragalus membranaceus（Fisch） Beg、白术饮片（炒）Atractylodes macrocephalaKoidz.及防风饮片Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schischk 均购自安徽中医药大学第一附属医院，由安徽医科大学药学院研究员吴婷妮鉴定为正品；DMSO（货号MFCD00002089）、MTT（货号EZ2411A401） 购自美国Sigma 公司；全蛋白提取试剂盒（强）（货号BC3710100T） 购自北京索莱宝科技有限公司；BCA 蛋白定量检测试剂盒（货号G2026） 购自武汉塞维尔生物科技有限公司；预染蛋白Marker（货号26616）、TRIzol Reagent（货号15596） 购自美国Thermo Scientific 公司；β-actin 抗体（货号AV0402）、OAT1 抗体（货号AB08214578）、OAT3抗体（货号AE081010） 购自北京博奥森生物技术有限公司；二抗（山羊抗兔，货号133599）、二抗（山羊抗鼠，货号133499） 购自北京中山金桥生物有限公司；ECL 超敏化学发光液（货号161204-34，美国Advansta 公司）；PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒（货号RR036Q）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（货号RR820 A） 购自宝日医生物技术（北京） 有限公司。

1.4 仪器 Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽、PowerPacTMBasic 电泳仪电源、Bioshine ChemiO 4600 电泳仪电源、CFX ConnectTM荧光定量PCR 检测系统均购自美国Bio-Ead 公司；Multiskan MK3 酶标仪、TE Thermo Cycle 逆转录仪均购自美国Thermo Scientific 公司。

2 方法

2.1 药物制备 参考本课题组前期实验方法［10］，将黄芪、白术、防风按照3∶1∶1（60 g∶20 g∶20 g） 比例混合，加入6 倍体积超纯水，浸泡1 h，加热煮至沸，用文火继续煎煮40 min，趁热用双层纱布过滤；收集滤渣，加入4 倍体积超纯水按相同的方法继续煎煮1 次；整合2 次滤液，加中火继续煎煮成浓缩液，最后将药液定量至质量浓度为2 g 生药／mL（玉屏风水煎剂） 药液。用相同的方法分别制备黄芪、白术、防风水煎剂（各组水煎剂最终质量浓度为1.2 g 生药／mL）。

2.2 分组及给药 将大鼠分为正常组、玉屏风组（10 g 生药／kg）、白术组（6 g 生药／kg）、防风组（6 g 生药／kg）、黄芪组（6 g 生药／kg），每组6只，灌胃给药1 次／d，连续给药21 d。取肾脏保存。

2.3 MTT 实验 参考文献［11］。将细胞悬液接种在96 孔板（100 μL／孔，0.5×104～1×104／孔），边加细胞悬液边吹打以确保每孔细胞数均等，培养6 h 贴壁，各组给予不同质量浓度药物（0、50、60、70、80、90、100 mg 生药／mL），药物处理24 h；每孔加入20 μL MTT，避光孵育4 h，弃去上清液；每孔加入150 μL DMSO，放置摇床上震荡10 min，用酶标仪检测490 nm 处OD，每组设3个复孔取平均值进行计算。细胞存活率＝［（OD实验组-OD空白组） ／（OD对照组-OD空白组）］×100%。

2.4 Western blot 法检测OAT1／3 蛋白表达 参考文献［12］。大鼠肾脏及细胞样品总蛋白的提取按照全蛋白提取试剂盒步骤进行提取，采用BCA 蛋白定量检测试剂盒对样品进行定量。配置10% 分离胶和5% 浓缩胶进行电泳，80 V 恒压电泳30 min，电压120 V 电 泳70 min；转膜设置为200 mA恒流；一抗（OAT1 为3∶7 000，OAT3 为3∶7 000，β-actin 为1∶4 000） 孵育过夜，次日加入二抗（1∶4 000） 孵育1 h，最后放置于凝胶成像仪内发光采图，通过Image-Pro Plus 6.0 测定其灰度值，采用β-actin 作为内参进行相对定量比较。

2.5 RT-PCR 法检测OAT1／3 mRNA 表达 参考文献［13］。大鼠肾脏及细胞总RNA 的提取按照RNA 提取试剂盒进行提取，使用Nanodrop 2000 检测RNA 的浓度及纯度。按照PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒进行逆转录，反应条件为37℃、14 min，85℃、30 s，1个循环。PCR 反应进行扩增，反应体系为10 μL，所需正反向引物各加入0.3 μL，无酶水1.4 μL，cDNA 3 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 5 μL；所需引物序列如表1，每个待检基因重复做3个反应孔。PCR 反应条件为95℃预变性30 s，然后进入循环阶段，每个循环包括95℃变性15 s，60℃退火60 s，60℃延伸到95℃，每15 s 升温0.3℃，共40个循环。组织RNA 以GAPDH作为内参，细胞RNA 则以ACTB作为内参，用2-△△ct方法计算目的基因的相对表达。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 统计学分析 采用GraphPad Prism7 软件来分析，数据以（） 来表示，多组间比较采用方差分析，以P≤0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度药物对HEK-293 细胞存活率的影响 如表2 所示，随着各药物浓度增加HEK-293细胞存活率逐渐下降，黄芪、白术24 h 安全给药浓度为0～60 mg 生药／mL，玉屏风组、防风组24 h安全给药浓度为0～70 mg 生药／mL。

表2 不同浓度药物对HEK-293 细胞存活率的影响（n＝3）Tab.2 Effects of different concentrations of drugs on the survival rate of HEK-293 cells（n＝3）

3.2 玉屏风水煎剂对HEK-293 细胞OAT1／3 蛋白表达的影响 如图1 所示，与正常组比较，玉屏风、白术、防风水煎剂能抑制HEK-293 细胞OAT1蛋白表达（P＜0.01），黄芪水煎剂促进HEK-293细胞OAT1 蛋白表达（P＜0.01），并且玉屏风组相较于黄芪组OAT1 蛋白表达下调（P＜0.01）；与正常组比较，玉屏风、防风水煎剂能抑制HEK-293细胞OAT3 蛋白表达（P＜0.01），白术、黄芪水煎剂能促进OAT3 蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），并且玉屏风组相较于黄芪组OAT3 蛋白表达下调（P＜0.01）。

3.3 玉屏风水煎剂对HEK-293 细胞OAT1／3 mRNA 表达的影响 如图2 所示，与正常组比较，玉屏风、白术、防风水煎剂能抑制HEK-293 细胞OAT1 mRNA 表达（P＜0.01），玉屏风、防风水煎剂能抑制 HEK-293 细 胞OAT3 mRNA 表 达（P＜0.05），白术、黄芪水煎剂能促进HEK-293 细胞OAT3 mRNA 表达（P＜0.05，P＜0.01）；与黄芪组相比较，玉屏风组OAT1／3 mRNA 表达下降（P＜0.05，P＜0.001）。

3.4 玉屏风水煎剂对大鼠肾组织中OAT1／3 蛋白表达的影响 如图3 所示，与正常组比较，玉屏风、防风、白术水煎剂抑制大鼠肾组织OAT1 蛋白表达（P＜0.05），玉屏风组相较于黄芪组OAT1 蛋白表达下降（P＜0.01）；与正常组比较，玉屏风水煎剂抑制大鼠肾组织OAT3 蛋白表达（P＜0.05），而白术水煎剂促进大鼠肾组织OAT3 蛋白表达（P＜0.01）。

3.5 玉屏风水煎剂对大鼠肾组织中OAT1／3 mRNA表达的影响 如图4 所示，与正常组比较，玉屏风、防风、白术水煎剂抑制大鼠肾组织OAT1mRNA 表达（P＜0.01）：玉屏风、防风水煎剂抑制大鼠肾组织OAT3 mRNA 表达（P＜0.01），而白术水煎剂促进大鼠肾组织OAT3 mRNA 表达（P＜0.01）。与黄芪组比较，玉屏风组OAT1／3 mRNA 表达下降（P＜0.01）。

图2 玉屏风及水煎剂对HEK-293 细胞OAT1／3 mRNA表达的影响（n＝3）Fig.2 Effects of YPFD on the expression of OAT1／3 mRNA in HEK-293 cells（n＝3）

4 讨论

方剂配伍是中医临床治疗疾病的主要用药方式，临床实践表明，中药复方往往会比单一的中药材产生更好的疗效和更低的毒性作用［14-15］。本课题组前期实验研究［10］显示，白术＋黄芪配伍组相较于黄芪组用药，能明显增加其主要成分黄芪甲苷在大鼠体内AUC、t1／2，降低黄芪甲苷的清除率。提示这种由药物相互作用引起的药动学的改变可能与黄芪甲苷体内排泄有关。由黄芪甲苷的结构解析可以判断黄芪甲苷在体内可能以阴离子的形式存在，有研究［16］表明，肾脏排泄是黄芪甲苷的重要排泄途径，协同效应可能与黄芪甲苷肾脏排泄过程的变化有关。OAT1／3 蛋白在调节肾脏排泄及内源性和外源性有机阴离子（包括各种药物及其代谢物）的再吸收方面起着很重要的作用。因此本课题考察了玉屏风及其组分黄芪、白术、防风水煎剂对大鼠肾脏及HEK-293 细胞中OATs 的2个亚型OAT1 和OAT3 的蛋白和基因表达的影响。

图3 玉屏风水煎剂大鼠肾组织中OAT1／3 蛋白表达的影响（n＝5）Fig.3 Effects of YPFD on OAT1／3 protein expression in kidney tissue of rats（n＝5）

图4 玉屏风水煎剂对大鼠肾组织中OAT1／3 mRNA 表达的影响（n＝5）Fig.4 Effects of YPFD on OAT1／3 mRNA expression in kidney tissue of rats（n＝5）

根据大鼠肾组织Western blot 结果显示，与正常组和黄芪组相比，玉屏风组的OAT1／3 蛋白表达出现显著降低，这与检测OAT1／3 mRNA 表达结果相同。而且HEK-293 细胞中OAT1／3 蛋白及mRNA表达调节作用与动物体内相似。这些实验结果结合前期药动学实验结果足以表明，玉屏风可能通过下调肾脏中OAT1／3 mRNA 表达，降低OAT1／3 蛋白表达，从而减少体内黄芪甲苷的肾脏排泄，提高其生物利用度。玉屏风和防风药物毒性很低，在一定的剂量使用范围内比较安全，对OATs 抑制作用显著，因此，在玉屏风、防风联合其它药物使用时，应当考虑药物相互作用而产生毒副作用。

玉屏风对有机阴离子家族OAT1、OAT3 蛋白抑制作用可能与其组方内黄芪甲苷生物利用度增高、药效增强有关。但它们对OAT1／3 蛋白和基因所产生抑制作用的机理尚不明确，以及对肾脏其它药物转运体的影响有待更进一步研究。