HPLC 法同时测定茶芎苯酞类有效部位中5 种成分

钟应淮张国松奉建芳程 勐夏明艳刘 梦李东勲刘雪梅*

（1.广西中医药大学药学院， 广西南宁530200； 2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心， 江西 南昌330006； 3.江西中医药大学， 江西 南昌330006）

茶芎Lgusticum sinenseOliv.cv.Chaxiong 又名抚芎，系伞形科藁本属植物，其根茎是江西特产中药材之一，主产于江西省九江地区的瑞昌、武宁、德安等地［1］。其性温、味辛，归肝、胆、心包经等，具有行气活血、祛风止痛之功效，临床上有时与川芎混用，且在1996 年首次被列入《江西省中药材标准》［2-3］。药理实验表明，茶芎挥发油对中枢神经系统、心血管系统、子宫平滑肌等均有明显的生理活性，还具有增强免疫力和镇痛作用，且毒性较低［4-5］。

近年来关于其化学成分、药理作用和制剂工艺的研究一直偏少。本课题组目前对茶芎的化学成分进行系统研究，发现其中含有大量的苯酞类化合物，这些化合物主要分为苯酞单体（主要存在于挥发油中） 和苯酞二聚体（主要存在于重组分中），其中苯酞单体有正丁基苯酞，Z-藁本内酯、丁烯基苯酞、新蛇床内酯、洋川芎内酯A、senkyunolide F、senkyunolide B 等28个化合物；苯酞二聚体有欧当归内酯A、tokinolide B、（Z） -6，8′-7，3′-二聚藁本内酯等［6-8］。

现代药理研究发现，茶芎中的苯酞类成分可以增强冠脉血流量、舒张血管，可用于抗血栓以及改善局部脑缺血引起的脑水肿［9-12］。课题组将采自江西省德安县的新鲜茶芎根茎在常温下阴干、粉碎，结合95%乙醇提取与乙酸乙酯萃取即可得到苯酞类成分的粗提物，再利用特殊的液-液分离技术POPE 分子精馏，依靠不同物质分子运动平均自由程的差别从而实现不同成分的分离，最终得到纯度在90% 以上的茶芎苯酞类有效部位（Phthalide target areas of Chaxiong，CPTA）［13］。经 过13CNMR、1H-NMR 和MS 的鉴定，CPTA 中已较为明确的5 种成分分别为洋川芎内酯A、Z-藁本内酯、正丁基苯酞、新蛇床内酯和丁烯基苯酞。本实验采用HPLC 法同时测定CPTA 中5 种成分的含有量，以期为茶芎苯酞类有效部位的质量控制提供参考，同时，也为后续研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪（配备SPDM20 A型PDA 紫外检测器，SIL-20A 自动进样器，CTO-20AC 柱温箱，Labsolutions 工作站）、UV-2550 紫外可见分光光度计（日本Shimadzu 公司）；MS 105 DU型电子天平（瑞士Mettler toledo 公司）；BSA2202S型电子天平（德国Sartorius 公司）；BCD-239 K 电冰箱（海尔集团）；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-82A 气浴恒温振荡器（金坛区白塔新宝仪器厂）；SMART超纯水系统（力康生物医疗科技控股集团）。

1.2 试剂与药物洋川芎内酯 A（批号DST180508-008，纯度98.84%）、正丁基苯酞（批号DST180717-002，纯度98.44%）、Z-藁本内酯（批号DST180815-007，纯度98.93%） 均购自成都德思特生物技术有限公司；新蛇床内酯（批号CHB1810707，纯度98.48%）、丁烯基苯酞（批号CHB170305，纯度＞98.0%） 均购自成都克洛玛生物科技有限公司；CPTA（批号170713、170918、170920、180106、180107）；所用甲酸、乙酸和磷酸皆为分析纯、甲醇、乙腈为色谱纯，均由西陇科学股份有限公司生产，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 样品制备 新鲜茶芎根茎50 kg，室温下阴干，取其中10 kg 粉碎，过20目筛，6 倍量95%乙醇回流提取2 次，每次1.5 h。合并滤液，减压浓缩得到稠浸膏，将稠浸膏分散于2 L 水中，充分混匀后用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂得到乙酸乙酯萃取部位。最后将该萃取部位采用POPE 分子精馏，可得轻组分和重组分，轻组分即为CPTA，得率为0.93%。

2.2 色谱条件 AkzoNobel Kromasil® 100-5-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相水（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，38%～42% B；10～36 min，42%～45% B；36～55 min，45%～48% B；55～60 min，48%～38%B）；检测波长280、230 nm（在280 nm 波长下检测洋川芎内酯A 和Z-藁本内酯，在230 nm 波长下检测正丁基苯酞、新蛇床内酯与丁烯基苯酞）；体积流量1.0 mL／min；柱温30℃；进样量20 μL。

2.3 溶液配制

2.3.1 混合对照品溶液 精密称取对照品洋川芎内酯A 22.87 mg、正丁基苯酞10.41 mg、Z-藁本内酯36.58 mg、新蛇床内酯10.56 mg、丁烯基苯酞11.39 mg，分别置于25 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀，即得相应对照品贮备液。分别精密吸取8、1、6、8、1 mL 于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀即得。

2.3.2 供试品溶液 将CPTA 放置于气浴恒温振荡器中，40℃微热使其呈均一透明状。称取CPTA约200 mg，置50 mL 棕色量瓶中，加入适量甲醇并超声5 min（250 W，40 kHz） 使其溶解。取出，甲醇定容至刻度，摇匀，得溶液。从该溶液中精密吸取2 mL 置25 mL 棕色量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 阴性对照溶液 阴性对照溶液为纯甲醇溶液，取适量过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 系统适应性与专属性试验 取“2.3” 项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，在“2.2” 色谱条件下进样。由图1 可知，对照品溶液和供试品溶液在图谱相同位置处有对应的吸收峰，各峰间分离度皆大于 1.5，对称因子0.95～1.05，各成分主峰理论塔板数皆大于5 000，且阴性对照溶液在相同位置并无干扰，表明方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 线性关系考察取“2.3.1” 项下混合对照品溶液适量，分别稀释至2、4、8、10、16倍，即得一系列梯度的混合对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，结果见表1，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度试验 精密吸取“2.3.1” 项下混合对照品溶液20 μL，在“2.2” 项色谱条件下连续进样6 针，测得洋川芎内酯A、正丁基苯酞、新蛇床内酯、Z-藁本内酯和丁烯基苯酞的峰面积RSD分别为0.46%、0.71%、0.41%、0.71%、0.84%，表明仪器精密度良好。

选取我院2016年1月～2018年6月老干部病房收治的100例患者分为优质护理组及护理风险评估干预组两组。优质护理组50例，男34例，女16例；年龄77～87岁，平均（63.27±2.85）岁。护理风险评估干预组50例，男35例，女15例；年龄76～88岁，平均（63.42±2.96）岁。组间性别、年龄等一般资料作比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.7 重复性试验 取同一批CPTA 样品（批号170713） 6 份，每份约200 mg，精密称定，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样，测得洋川芎内酯A、正丁基苯酞、新蛇床内酯、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞的平均含有量分别 为 33.77%、1.37%、16.52%、37.98%、2.43%，RSD 分别为1.48%、1.60%、1.39%、1.43%、1.35%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取CPTA 样品（批号170713）1 份，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、12、18、24、36 h后，在“2.2” 项色谱条件下进样，测得洋川芎内酯A、正丁基苯酞、新蛇床内酯、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞的峰面积RSD 分别为0.73%、0.84%、0.75%、0.69%、1.07%，表明供试品溶液在室温条件下36 h 内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知准确含有量的CPTA 样品适量，共9 份，分别配制低、中、高3 种不同浓度的样品，每种3 份。1～3 号样品中对照品与供试品溶液的加入体积比例为0.5∶1，4～6号样品中对照品与供试品的加入体积比例为1∶1，7～9 号样品二者的加入体积比例控制为1.5∶1，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，计算加样回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（%， n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（%， n＝9）

2.10 样品含有量测定 取5 批CPTA 样品（批号分别是 170713、170918、170920、180106 和180107），各3 份，精密称定，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样，计算各成分的含有量和RSD，见表3。

3 讨论

3.1 检测波长 将洋川芎内酯A、正丁基苯酞、Z-藁本内酯、新蛇床内酯和丁烯基苯酞对照品稀释至合适浓度，在190～800 nm 范围内进行全波长扫描，结果显示，洋川芎内酯A 在278 nm 处有最大吸收峰，Z-藁本内酯在282、294、323 nm 处均有吸收峰，且3个吸收峰都较为强烈；正丁基苯酞在227、274、80 nm 处均有吸收峰，但274、280 nm处的吸收峰较小；新蛇床内酯在218 nm 处有较为强烈的吸收峰，但当检测波长大于250 nm 时完全没有紫外吸收，因此其最佳检测波长范围为215～235 nm；丁烯基苯酞在216、235、260、312 nm 处均有吸收峰，但312 nm 的吸收值较小。

表3 各成分含有量测定结果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n＝3）

3.2 色谱柱 实验前期考察了Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Hypersil BDS2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 对样品中5 种成分的分离效果，因新蛇床内酯、Z-藁本内酯和丁烯基苯酞3 种成分的极性极为接近，前3 种色谱柱对其分离效果不佳，只有Kromasil 100-5-C18柱实现了5 种成分的分离，相邻各主峰间分离度大于1.5，且基线平稳，峰形较好，因此采用Kromasil 100-5-C18柱。

3.3 流动相 课题组尝试了甲醇-乙腈1∶1-水、甲醇-乙腈3∶1-水、甲醇-乙腈1∶3-水等一系列的混合系统［15-16］，结果显示，使用前二者，新蛇床内酯与丁烯基苯酞峰形重合，使用甲醇-乙腈1∶3-水混合系统时，Z-藁本内酯与新蛇床内酯峰形重合，完全不能实现新蛇床内酯、Z-藁本内酯和丁烯基苯酞3 种成分的分离，因此混合系统不宜采用。此外，为了减轻峰形拖尾，课题组研究了在乙腈-水系统情况下，在水相中加入0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%磷酸等有机酸，但最后发现酸的加入在230 nm 波长处溶剂峰吸收较大，且基线漂移严重，对样品的轻度拖尾并无明显改善，因此水系中不宜加入有机酸等。综合以上研究，流动相乙腈-水能实现样品中5 种物质的分离，峰形只有轻度拖尾。

3.4 柱温与体积流量 考察了25、30、35、40℃对出峰时间和峰形的影响。结果显示，25、30℃柱温时峰形较好，各峰分离度均能达到要求；35、40℃时出峰虽快，但新蛇床内酯、Z-藁本内酯和丁烯基苯酞不能实现较好的分离，考虑到25℃柱温有时较难恒定，因此选择30℃。

本研究考察了0.8、1.0、1.2 mL／min 3 种不同体积流量对峰形与出峰的影响，0.8 mL／min 时出峰时间明显减慢，且样品中的新蛇床内酯、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞分离度不符合要求；1.0、1.2 mL／min 时峰形相差不大，各峰也能明显分开，但1.2 mL／min 时系统压力偏高，为延长液相使用寿命和保护色谱柱，最终选择1.0 mL／min。

3.5 其他 样品测定中，180107 批样品5 种成分的含有量皆比前4 批偏高，这可能是不同批次的药材由于生长环境不同、在采收或加工过程的差异所造成的［17］。因此，原料药材应从来源控制，建立并健全多指标成分评价茶芎苯酞类有效部位质量的方法［18］，以期为后续制剂研究提供质量保证。

在实验过程中，对照品Z-藁本内酯配制成贮备液（约1.3 mg／mL） 后，即便在4～8℃下低温保存也不稳定，容易发生降解并产生大量杂质，因此应现配现用，或者在-20℃低温环境下保存。