肺纤方提取工艺的优化

刘 艺朱启勇谌晓莉肖庆龄*鞠建明*

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院， 江苏 南京210028； 2.江苏省中医药研究院， 江苏 南京210028）

中药复方具有多成分、多靶点、协同发挥疗效的特点，在研究其提取工艺的过程中倾向于采用能反映整体提取效果的指标，而不是某一种或一些指标成分［1-2］。指纹图谱作为一种综合、整体、可量化的定性定量分析手段，能较好地体现复方制剂中各类成分与疗效的相关性，国内外主要将其用于成分分析和质量控制研究［3-10］。由于中药复方提取物成分复杂、各成分权重系数难以确定，故需要结合统计学方法进行综合评价。主成分分析常被应用于综合评价［11-12］，基于其方差最大原则，把数据中的自变量进行归一化处理，减少相互重叠信息，即降维思想，同时将多指标转化为少数相互独立的综合指标，用于反映大部分信息。肺纤方为江苏省中西医结合医院全国名老中医朱启勇主任的临床验方，由丹参、赤芍、桃仁、水蛭、麦冬、木蝴蝶等药材组成，具有补肺肾阴、化肺络瘀之功效，临床上用于治疗阴虚血瘀引起的肺间质纤维化，在常规治疗基础上联合其治疗时可使动脉血气、肺功能、症状积分明显改善，疗效显著。但该方剂型为汤剂，患者使用不便，故拟按照医院制剂备案技术要求，在物质基础不发生改变的前提下将其开发为颗粒剂。本实验遵循中医传统采用水提取方法，依据中药复方制剂整体性的特点，将指纹图谱技术与主成分分析相结合优化肺纤方提取工艺，以期将该方开发成医院制剂、服务广大患者奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters 高效液相色谱仪，配置Alliance 2695 四元泵、自动进样系统、2996 二极管阵列检测器（美国Waters公司）；Milli-Q型纯水器（美国Millipore 公司）；AT201型电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Buchi-200 旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）。

1.2 试剂与药物 丹参（批号20180401-04） 购自贵州同德药业有限公司；水蛭（批号170824） 购自南京松龄中药饮片有限公司；桃仁（批号1708010）、赤芍（批号1802003）、麦冬（批号1804011） 购自亳州市万珍中药饮片厂；木蝴蝶（批号20170724） 购自南京松龄中药饮片有限公司，均由江苏省中医药研究院钱士辉研究员鉴定为正品，符合2015 版《中国药典》 一部相关规定。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取液制备 称取方中各味药材共9 份，每份含药量为114 g，置于圆底烧瓶中，按照表1 因素水平回流提取后，考察料液比（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C） 对提取效果的影响，合并后浓缩至500 mL，冷藏备用。

表1 因素水平

2.2 供试品溶液制备 精密吸取 “2.1” 项下提取液5 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，超声（功率250 W） 处理30 min，放冷，定容后摇匀，12 000 r／min离心10 min，即得。

2.3 色谱条件奥泰AlltimaTMC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脱（0～20 min，2%～3% 乙腈；20～21 min，3%～6% 乙腈；21～41 min，6%～14%乙腈；41～71 min，14%～27%乙腈；71～86 min，27%～45% 乙腈）；体积流量1.0 mL／min；柱温35℃；检测波长283 nm；进样量10 μL。

2.4 精密度试验 按照2015 年版《中国药典》 方法进行考察，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得33个共有峰保留时间RSD 为0.04%～1.48%，峰面积RSD 为0.32%～1.95%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 按照2015 年版《中国药典》 方法进行考察，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得33个共有峰保留时间RSD 为0.63%～2.66%，峰面积RSD 为0.02%～1.22%，表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 按照2015 年版《中国药典》 方法进行考察（24 h 内），在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得33个共有峰保留时间RSD 为0.15%～1.36%、峰面积RSD为0.54%～2.98%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 HPLC 指纹图谱建立 精密吸取9 份“2.2” 项下供试品溶液，每份10 μL，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）对所得结果进行分析，采用中位数法生成对照指纹图谱（R），共标定33个共有峰，见图1。

图1 9 批样品HPLC 指纹图谱

2.8 共有色谱峰的标识及归属分析 精密称取方中处方量药材（水蛭主要包含蛋白质和氨基酸，故未对其进行检测），置于圆底烧瓶中，加12 倍量水回流提取2 次，每次60 min，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样10 μL 测定，记录色谱图，确认共有峰药材归属，结果见图2。确认了28个共有峰的来源，分别来自丹参（10、16、17、25、30、32 号峰）、麦冬（7、18、19、20 号峰）、赤芍（1、2、3、5、24、26 号峰）、桃仁（9、14、15 号峰）、木蝴蝶（11、13、14、21、27、28、29、31、33 号峰）。

图2 肺纤方及组成药材的HPLC 色谱图

2.9 数据处理

2.9.1 主成分分析 将表1 数据录入SPSS 22.0 软件进行因子分析，得到可以代表原始峰面积的主成分、贡献率及解释的总方差，见表2。主成分个数的提取原则为筛选特征值大于1 者［13］，故前6 种成分的初始特征值分别为17.678、5.876、3.606、2.539、1.477、1.073，方差贡献率分别为 53.569%、17.807%、10.927%、7.694%、4.477%、3.251%，累积方差贡献率为97.725%，包含了大部分相关信息。

将第1～3 主成分作为变量，建立三维投影图载荷图（图3），在投影图中距离原点较远的点为权重较大的成分。在第1、第2 主成分中，峰1～6、8～18、20、22、25～26、30～31、33 的系数较大，可反映上述色谱峰的相关信息；同理，第3 主成分主要反映了峰7、23 的相关信息。

图3 各主成分载荷图

表2 各主成分总方差

2.9.2 正交试验分析 以提取指纹图谱共有峰主成分所得综合评分（F） 为评价指标，主成分得分＝主成分因子得分× 相应方差算数平方根［14］，即F＝0.535 69F1＋0.178 07F2＋0.109 27F3＋0.076 94F4＋0.044 77F5＋0.032 51F6；料液比（A）、提 取时间（B）、提取次数（C） 为影响因素，正交试验优化提取工艺，结果见表3，方差分析见表4。

表3 试验设计与结果

表4 方差分析

由表3 可知，各因素影响程度依次为A＞B＞C，理论最优工艺为A3B3C3；由表4 可知，各因素均无显著影响（P＞0.05）。综合考虑时间、成本等各方面因素，最终确定最优工艺为A3B2C2，即加12 倍量水提取2 次，每次60 min。

2.9.3 验证试验 根据处方比例称取3 份药材，按“2.8.2” 项下优化工艺提取，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，计算各共有峰面积主成分综合评分，结果见表5。由此可知，工艺稳定可行，可用于工业化生产。

表5 验证试验结果（n＝3）

3 讨论

中药复方发挥药效的关键，在于其多成分、多靶点的协同作用。因此，在选择中药复方最优提取工艺的过程中，如果只选用某一或某几种成分的含有量作为评价指标，则无法反映全方整体提取水平。

指纹图谱是一种评价中药复杂成分体系质量标准的有效手段，能较好地反映其整体上的相近程度，包括以峰面积、相对保留时间、相对峰面积为指标进行定性和半定量分析，在中药复方提取工艺优化中具有一定优势［15］。本实验比较了不同梯度甲醇-水、乙腈-水的分离效果，确定文中色谱条件；通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（A版） 对9 批样品HPLC 指纹图谱进行分析，得到对照指纹图谱（R） 及33个共有峰，并将其作为提取工艺优化指标。方法学研究结果显示，本实验所建立的方法具有良好的精密度、稳定性、重复性，可用于指标成分定量分析。

考虑到各组分权重系数难以确定，本实验采用主成分分析，将高维数据降到低维，把33个共有峰组合成6个涵盖了原始色谱峰97.725%信息的综合指标，从而较好地浓缩、简化数据，为进一步正交试验极差分析和方差分析奠定基础。

综上所述，本实验建立了肺纤方HPLC 指纹图谱，并与主成分分析等化学计量学方法相结合，用未知结构成分的模糊数据（特征色谱峰的总因子得分） 进行多指标的综合评定，从而优化该方提取工艺。该方法既全面反映了药材整体提取水平，又在数据处理方面简单易行，具有较好的实用性和借鉴意义。