黄芪-丹参药对对特发性肺纤维化小鼠肺泡炎症及纤维化的影响

王丽娜 罗 竹 黄小朵 徐昌君 严春兰 罗进程 杨长福

（贵州中医药大学， 贵州 贵阳550002）

特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）发病早期，肺组织炎症细胞浸润会引起肺间质胶原蛋白增生，破坏正常肺泡结构，引起肺泡数量减少、闭索，加速IPF 的发展。这种炎症细胞浸润形成的纤维化肺组织，可能与焦亡有关。焦亡是一种炎性程序性细胞死亡的方式，已经有报道显示细胞焦亡可以参与神经炎症［1］、肿瘤［2］、心血管疾病［3］、感染类疾病［4］等的炎性发展过程。药物干预能够抑制焦亡，改善炎症。

实验研究提示，黄芪、丹参可抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织NF-κB 活化，有利于减轻气道重构［1］。课题组前期研究发现由黄芪、党参、百部、补骨脂、桑白皮、丹参组成的加减补肺汤能改善博来霉素诱导的肺纤维化大鼠炎性细胞浸润，减轻肺纤维化程度［5］。黄芪甲苷通过增强自噬活性，可以降低焦亡蛋白caspase-1，IL-1β 和IL-18 等的表达，控制IPF 炎症和纤维化发生发展［6］。药对黄芪-丹参治疗肺纤维化是否与抑制焦亡有关，缺乏研究。因此，本实验研究药对黄芪-丹参对IPF 发病肺泡炎症、间质性纤维化的影响及其对细胞焦亡的调控作用。

1 材料

1.1 动物 SPF 级C57BL／6 健康雄性小鼠60 只，6 周龄，体质量（15±3） g，购自长沙维通利华实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（湘） 2018-0001。适应性喂养1 周，自由饮食、饮水。

1.2 药物黄芪购自贵州同济堂中药饮片有限公司，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.） Hsiao 干燥根，根据《中国药典》 2015 版，称取黄芪30 g，以1 倍量水量取，8 倍量水浸泡，用武火煮开后文火煎煮30 min，滤过，残渣加6 倍量水再煎煮2 次，滤过，合并滤液，浓缩过滤药物至50 mL，取30 ml 备用，药物浓度为0.6 g 生药／mL。丹参购自贵州同济堂中药饮片有限公司，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为唇形科植物Salvia miltiorrhizaBge.干燥根，根据《中国药典》 2015 版，称取丹参15 g，以1 倍量水量取，8 倍量水浸泡，用武火煮开后文火煎煮30 min，滤过，残渣加6 倍量水再煎煮2 次，滤过，合并滤液，浓缩过滤药物至50 mL，取30 mL 备用，药物浓度为0.3 g 生药／mL。黄芪-丹参药对（称取黄芪30 g，丹参15 g，方法同上，药物浓度为0.45 生药g／mL）。地塞米松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号131220）。

1.3 试剂 博莱霉素注射剂（日本化药株式会社，批号730342）；苏木精伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司，批号C0105）；Masson 胶原染色试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号20180424）；羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号20190508）；免疫组化试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司，批号k152411B）；抗体p-IKK（上海优宁维生物科技股份有限公司，批号72K1671）；抗体NF-κB（上海碧云天生物技术有限公司，批号AF1234）；抗体NLRP3（上海优宁维生物科技股份有限公司，批号315101s）；抗 体IL-1β（英 国Abcam 公司，批号G123187186-2）；DAB 显色液（北京中衫金桥生物技术有限公司，批号k1556158）；抗体TNF-α（英国Abcam 公司，货号ab1793）；总蛋白提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，批号P1250）；转膜液（美国Bio-Rad 公司，批号10026938）；10×TBST（北京索莱宝科技有限公司，批号20181101）；膜再生液（北京索莱宝科技有限公司，批号20180508）；PVDF 膜（德国默克公司，批号R8BA4734F）；ECL 超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司，批号1815a01）；5×电泳液（北京索莱宝科技有限公司，批号20181022）；BCA 蛋白定量试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号20314）。

1.4 仪器 DP73＋standard 1.6型显微镜摄像CCD 照相系统（日本奥林巴斯公司）；LD4-2型低速离心机（北京医用离心机厂）；SDS-PAGE 凝胶试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；蛋白凝胶电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；BIO-RAD半干转电转仪（美国Bio-Rad 公司）；BIO-RAD 凝胶成相系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模及分组 雄性C57BL／6 小鼠60 只，采用随机数字表法分为假手术组、模型组、地塞米松组、黄芪组、丹参组、黄芪-丹参药对组，每组10 只。4% 水合氯醛（10 mL／kg） 腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠呈仰卧位，固定于鼠台上。酒精棉球消毒颈部气管部位，用剪刀和手术镊逐层分离颈部气管部位皮肤，直至暴露气管，模型组及药物处理组使用注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入，缓慢注入博莱霉素（5 mg／kg）［3］，假手术组注入生理盐水，缝合，待其自然苏醒。

2.2 给药 造模后第2 天开始灌胃给药，参照《中药药理与实验方法》 人与小鼠表皮面积的换算方式确定黄芪组、丹参组、药对黄芪-丹参组小鼠的给药剂量分别为6、3、4.5 g／kg，地塞米松组小鼠的给药剂量为0.125 g／kg，给药体积为0.1 mL／10 g，假手术组和模型组给予生理盐水灌胃。1 次／d，连续给药28 d。

2.3 取材 小鼠给药灌胃28 d 后，小鼠禁食不禁水12 h，处死小鼠，将肺门部组织左侧肺叶置于4%多聚甲醛固定，右侧肺叶于冻存管中放置于-80℃冰箱备用。

2.4 HE 染色 肺组织按照常规方法固定、脱水、石蜡包埋后，小鼠肺组织石蜡切片二甲苯脱蜡2 次，按规定时间进行酒精梯度脱水，苏木精染色洗涤后，进行伊红染色，最后乙醇脱水，二甲苯透明2 次，中性树胶封片，显微镜观察拍片。

2.5 Masson 胶原染色 石蜡切片脱蜡，脱水步骤同“2.4” 项下。丽春红品红染色液染色，弱酸洗涤，磷钼酸溶液染色，弱酸溶液洗涤，苯胺蓝染色液染色，弱酸洗涤，酒精常规脱水脱水，二甲苯透明3 次，中性树胶封片，晾干后，低温保存，显微镜观察拍片。

2.6 羟脯氨酸含有量测定 配置相关试剂，称取100 mg肺组织，按照碱性水解法裂解进行样本前处理，调至合适pH 值。取1 mL 上清按照操作表的操作步骤操作，酶标仪检测550 nm 波长处OD，计算各组羟脯氨酸含有量。

2.7 免疫组化检测 脱蜡、脱水步骤同 “2.4” 项下，PBS 洗涤3 次，用柠檬酸缓冲液置于微波炉中进行抗原修复，冷却后，0.01% Triton 破膜打孔，3% H2O2灭活过氧化氢酶，免疫封闭液进行封闭，加入TNF-α 一抗，置于暗盒中，4℃冰箱孵育过夜。次日，载玻片复温，加二抗37℃孵育，DAB 显色，苏木精染色，常规方法脱水透明后进行中性树胶封片，显微镜观察拍片。

2.8 Western blot 检测 称取组织约80 mg，加入1 000 μL裂解液，匀浆机4 000 r／min 破碎组织，抽取0.5 mL组织匀浆液，静置，加入2 倍体积抽提试剂混匀，4℃静置10 min，10 000 r／min 离心，除去上下相液体，保留中间分离相的蛋白膜，1% SDS 溶解蛋白膜。BCA 蛋白定量检测，按照蛋白样品与上样缓冲液3∶1 的比例加入上样缓冲液，95℃煮沸蛋白变性。上样量为50 μg 蛋白质，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，电压80～120 V，电泳1.5 h，半干转25 V 电压转膜5 min；5% 脱脂牛奶封闭1 h，加入TNF-α（1∶500）、p-IKK（1∶ 1 000）、NF-κB（1∶ 1 000）、NLRP3（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000） 一抗，4℃孵育过夜，次日，1×TBST 洗涤3 次，5 min／次；加入二抗（1∶5 000），常温下轻度摇床孵育1 h，1×TBST 洗涤3 次，5 min／次，滴加超敏发光液，蛋白凝胶成像系统进行拍照。

2.9 统计学分析 采用Image-Pro Plus 6.0 专业图像分析软件进行免疫组化图像的分析，Image J 专业软件分析Western blot 条带。SPSS 21.0 统计学软件进行分析，数据以（） 表示，符合正态分布并且符合方差齐性时，多组间比较采用单因素方差分析。以P≤0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 肺组织HE 染色结果 假手术组小鼠肺泡间隔无增厚，无充血和水肿，结构清晰，无明显炎症改变；模型组小鼠肺泡间隔明显水肿，毛细血管充血，肺泡壁增厚，肺组织肺泡结构塌陷，肺泡腔内有大量炎症细胞出现，大量肺纤维结节存在于肺间质内，纤维化瘢痕形成；各给药组与模型组相比炎症细胞有所减少，地塞米松组与黄芪-丹参药对组有轻微炎症反应，肺泡结构相对清晰，纤维增生不明显，与模型组比较改善作用明。见图1。

3.2 肺组织Masson 胶原染色结果 假手术组小鼠肺组织肺泡结构清晰，肺泡间质内以气管为中心的少量胶原蓝染色为正常胶原表达的颜色；模型组肺泡塌陷，萎缩，有大量纤维胶原出现，呈实变样，说明纤维化程度加深。与模型组比较，给药组胶原纤维表达减少，地塞米松组与黄芪-丹参药对组肺纹理尚清晰，胶原染色不明显，与模型组相比较有明显改善作用。见图2。

图1 HE 染色观察肺组织肺泡炎症（×200）

图2 Masson 染色观察肺组织胶原纤维（×200）

3.3 肺组织羟脯氨酸含有量检测结果 与假手术组相比，模型组羟脯氨酸含有量升高（P＜0.01）；与模型组相比，地塞米松组与黄芪-丹参药对组的羟脯氨酸含有量降低（P＜0.01）。见表1。

表1 黄芪-丹参药对对肺组织羟脯氨酸含有量的影响（，n＝3）

注：与假手术组相比，＃＃P＜0.01；与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与黄芪-丹参药对药对组比较，△△P＜0.01。

3.4 免疫组化染色结果 假手术组小鼠有少量TNF-α 表达，与假手术组相比，模型组肺泡区与肺间质区的TNF-α 表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄芪-丹参药对组、黄芪组TNF-α 表达均降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图3、表2。

3.5 Western blot 测定结果 与假手术组比较，模型组TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 表达升高（P＜0.01），与模型组相比，黄芪-丹参药对能抑制上述蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）。见图4、表3。

4 讨论

我国是一个人口严重老龄化的国家，IPF 患病人数每年都呈增长趋势，保守估计有50 万患者。IPF 是一种慢性间质性肺病，起病隐匿，病情逐渐加重。IPF 一经诊断，平均生存期仅2.8 年，死亡率高于大多数肿瘤，被称为一种“类肿瘤疾病”。该疾病严重影响患者生活质量，因此受到了广泛的关注。目前，临床主要以糖皮质激素和免疫抑制剂等药物来治疗，但激素类药物存在一定副作用，甚至可导致呼吸道感染，中医治疗以益气活血为主，临床上取得较好疗效。

图3 免疫组化检测各组小鼠肺组织TNF-α 表达（IHC，×200）

表2 黄芪-丹参药对对小鼠肺组织TNF-α 表达的影响（， n＝6）

表2 黄芪-丹参药对对小鼠肺组织TNF-α 表达的影响（， n＝6）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与黄芪-丹参药对组比较，△△P＜0.01。

图4 Western blot 测定肺组织TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 蛋白表达

IPF 在中医归属于“肺痹” “肺萎” 范畴，主要病机为气滞血瘀。黄芪具有补气、利尿、排脓、生肌等功效，现代研究［7］发现黄芪还可以抗病毒、降血糖、抗氧化、改善记忆力和提高免疫力。黄芪中含有多种活性成分，其中黄芪总黄酮和总皂苷能够干预博莱霉素导致肺纤维化小鼠肺泡炎症，抑制早期纤维化结节的出现［6］。丹参具有活血凉血、化瘀消痈等功效。现代研究［8-9］表明，丹参不仅可以调节微循环、促进肝细胞再生，还可以抗脂质过氧化和抗肝纤维化。丹参水提分离得到的丹参素，可缓解大鼠肺泡炎和肺纤维化的进程，防治肺间质性纤维化［10-11］。丹参酮ⅡA可以抑制肺纤维化大鼠TGF-β1 蛋白表达，并且能够影响致纤维化关键性因子Smad2／3 信号通路［12］。药对是中医临床常用的相对固定的2个药味的配伍组合，是中药配伍应用的基本形式。黄芪-丹参药对可以降低防抗结核药物带来的副作用，从而保护肝功能，其原因可能是丹参能够协同黄芪产生抗氧化、清除氧自由基，改善肝脏微循环等作用［8-9］。

细胞焦亡是在细胞感染过程中参与多种疾病炎症过程的一种炎性细胞程序性死亡过程。当细胞受到外界微生物感染时，模式识别受 体（pattern-recognition receptors，PRRs） 识别相关分子模式，启动免疫反应，炎症细胞突破免疫应答，会诱导血液中的单核细胞转化为巨噬细胞，巨噬细胞在促炎因子TNF-α 的刺激下激活NF-κB 相关通路，通过接头蛋白ASC 募集半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原（pro-caspase-1），形成多蛋白复合体，称为炎症小体（inflammasome）［13］，其中以 NLRP3 炎症小体研究报道最多［14-15］。在焦亡激活信号通路中，pro-IL-1β／pro-IL-18 的表达是通过细胞膜上的Toll 样受体（Toll-likereceptors，TLR） TLR4 识别细菌脂多糖（LPS），激活NF-κB 信号通路而引起的。随后，细胞内的NLRP3 炎性小体可以识别相关分子模式，与接头蛋白ASC组装后，招募pro-caspase-1［16］，pro-caspase-1 发生自体剪切，活化成caspase-1［17］。caspase-1 激活pro-IL-1β／pro-IL-18，释放至胞外，从而引起细胞焦亡［18-19］。焦亡发生后，细胞膜崩解，释放胞质内毒素分子，引起炎症细胞趋化，并促进炎症细胞释放细胞因子。经研究发现，细胞焦亡过程对肺纤维化发生发展具有一定意义。TNF-α 作为激活细胞焦亡相关蛋白的关键促炎因子，重点参与了IPF 疾病过程中的细胞焦亡。

表3 黄芪-丹参药对对肺组织TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 的表达（， n＝3）

表3 黄芪-丹参药对对肺组织TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 的表达（， n＝3）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与黄芪-丹参药对组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

TNF-α 是一种生物活性广泛的胞浆性促炎因子，它可以参与多种病理过程，例如炎性反应、免疫应答和内毒素性休克等，并且可以产生抗肿瘤，调节免疫力和抗感染的作用［20］。研究发现肺纤维化的形成与毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞［21］的损伤有关，而这一过程，促炎因子TNF-α 发挥了重要作用，它刺激NF-κB 信号通路，使血管内的单核细胞转化为肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）。刺激活化后的AM 可以释放大量的炎性介质，从而损伤、破坏正常肺泡结构，引起肺泡数量减少、闭索，形成肺纤维化。在这一过程中，TNF-α 可以直接或间接激活NF-κB 信号通路，引 起 NLRP3 的蛋白表达，调 控caspase-1，引起细胞焦亡［22-23］。由此可见，细胞焦亡与肺泡炎症及间质性纤维化之间存在可能性的机制，有待进一步的探讨。

本实验在IPF 模型小鼠中观察黄芪-丹参药对对焦亡相关通路的调控作用。实验模型组的炎症反应和纤维化结节大量增生，肺纤维实变区TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 呈现高表达。黄芪、丹参、黄芪-丹参药对可不同程度下调TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 表达，其中黄芪丹参药对组较药物单独使用的治疗效果更佳。综上所述，药对黄芪丹参对IPF 有治疗作用，其作用机制可能通过抑制TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 等焦亡相关蛋白的表达，减轻炎症反应，最终调控IPF 的发生发展。