美洲大蠊醇提取物对小鼠急性免疫性肝损伤的影响

杨 帅 哈立洋 李阿溶 尹可欢 顾 健

（西南民族大学 药学院， 四川 成都610041）

美洲大蠊Periplaneta Americana L.俗名蟑螂，属蜚蠊科［1］。作为药物使用历史悠久，最早期记载于《神农本草经》，其性寒，味咸、有辛辣味，小毒，具有散瘀、消积、解毒等功效。现代药理研究显示，美洲大蠊具有抗肿瘤、改善血液循环、促进组织修复、增强免疫、保护肝脏功能等作用［2-4］。利用美洲大蠊的不同提取物，建立急性免疫性肝损伤小鼠模型，表明美洲大蠊能够有效治疗肝损伤，课题组前期实验结果表明，美洲大蠊75%乙醇提取物对刀豆蛋白A 诱导的急性免疫性肝损伤有一定的保护作用，但其用药剂量及调节淋巴细胞作用尚不明确，因此本实验通过对比美洲大蠊醇提物高、中、低3个剂量对刀豆蛋白A 诱导的急性免疫性肝损伤的保护作用，探究用药剂量对免疫性肝损伤的治疗作用，同时研究3个剂量组对T 淋巴细胞中CD4、CD8 细胞亚群的调节作用。

1 材料

1.1 动物 SPF 级，雄性KM 小鼠60 只，体质量18～25 g，合格证号0042449，生产许可证号SCXK（川） 2015-030，购自成都达硕实验动物有限公司，室温（23±2）℃，湿度50%～60%。SPF 级动物房适应性饲养1 周。

1.2 药物与试剂 美洲大蠊（四川好医生药业提供，批号ML-20170327），经西南民族大学药学院顾健教授鉴定为正品；刀豆蛋白A（美国Sigma 公司，批号ab15323）；联苯双酯（万邦德制药集团股份有限公司，批号A0-2j171108）；AST 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180828）；ALT 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180825）；MDA 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180827）；SOD 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180827）；无水乙醇（AR 级，规格2.5 L／桶，批号GB678-90，江苏海兴化工有限公司）。

1.3 仪器 全自动生化分析仪（江西特康科技有限公司）；722 可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司生产）；全自动封闭式组织脱水机（常州市中威电子仪器有限公司）；病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）；数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；荧光定量PCR 仪（美国应用生物系统公司）。

2 方法

2.1 药物制备 将虫体研磨成粉，干燥通风保存。取干燥虫粉500 g，加入5 倍量体积的石油醚，超声脱脂2 次，30 min／次，蒸发干燥，加入15 倍量体积的75% 乙醇，超声提取3 次，30 min／次，提取液合并浓缩干燥即得美洲大蠊醇提物，冷藏保存，现用现配。

2.2 造模及给药 将60 只小鼠随机分为6组，空白组、模型组、联苯双酯组（200 mg／kg） 及美洲大蠊醇提物高、中、低剂量组（90、60、30 mg／kg），每组10 只。张鹏［5］、甘 平［6］、石林琳［7］等研究美洲 大蠊醇提物 为100、200 mg／kg，因此为探究更适宜给药浓度，本次实验醇提物组设置低于上述浓度的高中低3个剂量组（90、60、30 mg／kg），为后续综合各梯度浓度探究更准确的量效关系提供实验依据。空白组和模型组给予同体积的纯净水灌胃，其他各组小鼠按照对应给药剂量灌胃给药，1 次／d，连续给药7 d；末次给药2 h 后，除空白组外，各组小鼠均尾静脉注射20 mg／kg 刀豆蛋白A 进行造模。造模结束的各组小鼠，均禁食不禁水，10 h 后，称定小鼠体质量。

2.3 血清ALT、AST 水平及肝脾指数的测定 造模10 h 后麻醉，眼球取血，分离血清。检测ALT、AST 水平。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏、脾脏称定质量，肝脏系数＝（肝脏质量／体质量） ×100%，脾脏系数＝（脾脏质量／体质量） ×100%。

2.4 肝脏组织中MDA、SOD 水平测定 造模10 h 后麻醉，小鼠脱颈处理，剪取部分肝脏组织，冰浴中用生理盐水制成10%肝匀浆，离心，取上清液检测SOD、MDA 水平。

2.5 HE 染色观察肝脏组织病理 取肝左叶同一部位组织，中性甲醛固定，常规制备切片，HE 染色，光镜下观察拍照。小叶增生（＜5%、5%～33%、33%～67%、＞67%） 分别记为0、1、2、3 分数；炎症浸润（无病灶、＜2个病灶／视野、2～4个病灶／视野、＞4个病灶／视野） 分别记为0、1、2、3 分数；点状坏死（无、少见、多见） 分别记为0、1、2 分数。

2.6 免疫组化检测淋巴细胞CD4、CD8 取肝脏组织，进行石蜡切片微波修复抗原染色与热抗原修复，使用DAB 显色，最后完成图像采集。

2.7 统计学分析 应用SPSS 18.0 软件进行分析，血清及肝组织的检测数据计量资料以（） 表示，符合正态分布且方差齐性资料采用独立样本t检验；病理学分级评分等级资料采用Ridit 检验。以P≤＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性免疫性肝损伤小鼠肝、脾系数的影响 与空白组比较，刀豆蛋白A 致急性肝损伤模型组小鼠肝、脾系数升高，肝脾肿大；与模型组比较，美洲大蠊醇提物组、联苯双酯组均能降低肝、脾系数（P＜0.05，P＜0.01），改善肝脾组织肿胀程度，见表1。

3.2 美洲大蠊醇提物对小鼠血清ALT、AST 水平的影响 与空白组相比，刀豆蛋白A 致急性肝损伤模型组小鼠血清ALT、AST 水平上升；与模型组比较，美洲大蠊醇提物均能降低ALT、AST 水平（P＜0.05，P＜0.01），见表2。

表1 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠脏器系数的影响（， n＝10）

表1 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠脏器系数的影响（， n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠血清AST、ALT 水平影响（， n＝10）

表2 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠血清AST、ALT 水平影响（， n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA 水平的影响 与空白组相比，刀豆蛋白A致急性肝损伤模型组小鼠肝组织MDA 水平明显上升，肝组织SOD 水平下降（P＜0.01）；美洲大蠊醇提物高、中剂量组可升高肝组织SOD 水平，降低MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01），见表3。

表3 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA 水平影响（， n＝10）

表3 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA 水平影响（， n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠肝脏组织损伤的影响 正常组肝脏被膜及门管区完整，肝细胞分叶明显，形态正常，未见病理变化；模型组肝脏被膜完整，肝细胞分叶不明显，肝索排列较为紊乱，肝细胞片状坏死、出血，肝细胞胞质出现大量空泡变性，有少量肝细胞空泡变性，伴少量炎性细胞；给药组被膜及门管区完整，肝细胞坏死、出血情况得到改善，空泡变性减轻，炎细胞浸润得到改善。见图1、表4。

图1 各组肝组织病理切片图（HE，×400）

表4 各组肝组织病理分级（n＝10）

3.5 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠肝组织淋巴细胞CD4、CD8 的影响 模型组小鼠肝组织CD4、CD8 的阳性细胞IOD 呈上升趋势，尤其是CD8 阳性细胞的上升幅度更大；与模型组比较，美洲大蠊醇提物清晰可见CD4、CD8 的阳性细胞IOD 下降（P＜0.01），说明美洲大蠊醇提物治疗刀豆蛋白A 诱导的免疫性肝损伤机制，可能是通过调节CD4、CD8 的阳性细胞数量，改善免疫功能紊乱，从而保护肝脏。见表5、图2～3。

4 讨论

肝损伤是临床上的常见病，各种物理和化学因素均可导致急、慢性肝损伤。肝损伤后，固有的免疫细胞分泌促纤维化因子，如TGF-β、血小板来源生长因子（PDGF）、IL-13 和IL-4 等，导致肝纤维化，并逐渐发展成肝小叶结构的破坏及结节形成，最终演变成肝硬化或肝癌。因此，控制或逆转肝损伤具有重要意义。实验依据操作简便，具有肝脏特异性等特点［8-9］，所测指标模型组与空白组比较均有显著性差异，说明造模成功。

表5 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠T 淋巴细胞亚群的影响（， n＝10）

表5 美洲大蠊醇提物对刀豆蛋白A 致急性肝损伤小鼠T 淋巴细胞亚群的影响（， n＝10）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

图2 CD4 的免疫组化图（IHC，×100）

图3 CD8 的免疫组化图（IHC，×100）

血清AST、ALT 可以反映肝细胞受损程度以及线粒体损伤的情况，根据肝组织中MDA、SOD 水平变化，能够推测出机体细胞受氧自由基攻击以及减少细胞和组织损伤的程度［9-11］。美洲大蠊醇提物调节T 淋巴细胞方面，尚无相关报道，机体维持正常的免疫功能状态有赖于T 淋巴细胞亚群维持一定的比例，因此本次实验探究美洲大蠊醇提物对T 淋巴细胞亚群的调节作用。与空白组比较，模型组CD4 和CD8 细胞亚群的数量上升，CD8 细胞亚群趋势更为显著，强阳性细胞数目增多；与模型组比较，美洲大蠊醇提物下调CD4 和CD8 细胞亚群的数量，改善细胞阳性程度，调节T 淋巴细胞亚群，使其达到一个相互平衡的状态，减轻对肝细胞的毒性，改善免疫功能紊乱，阻断肝损伤从急性向慢性的进一步发展。

本研究显示，美洲大蠊醇提物均可以不同程度的降低肝脾系数和血清ALT、AST 水平，降低肝脏组织中的MDA水平，升高SOD 水平，美洲大蠊醇提物高剂量组效果优于醇提物中剂量组及醇提物低剂量组，美洲大蠊醇提物能抑制肝脏和脾脏的免疫反应，减轻肝脏细胞损伤，以及抗脂质过氧化反应和清除肝内自由基。同时，美洲大蠊醇提物调节T 淋巴细胞亚群，使其达到一个相互平衡的状态，减轻对肝细胞的毒性，改善免疫功能紊乱，抑制急性免疫性肝损伤向慢性免疫性肝损伤的进一步发展，从而保护肝脏。