木犀草素通过调控JAK2／STAT3 信号通路对Hela 细胞增殖和凋亡的影响

肖美芳 陆 喆 陈柳英 陈 芬

（海南省妇女儿童医学中心， 海南 海口570206）

宫颈癌是常见的恶性肿瘤，在全球女性中其发病率仅次于乳腺癌，居于第2 位，对妇女的健康有着重要的影响［1］。近年来，宫颈癌的发病机理及治疗手段受到了广泛的关注，2016 年世界卫生组织公布，全球每年宫颈癌新发病例超过47 万。宫颈癌的死亡率较高，在中国每年新发病例超过13 万，其中死亡约5.3 万，且死亡率仍呈上升趋势［2］。木犀草素（Luteotin） 是一种天然的黄酮类化合物，具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化和抗癌［3-4］。本研究探讨了木犀草素对宫颈癌Hela 细胞的增殖和凋亡的作用，以及其相关信号通路。

1 材料

1.1 细胞株 Hela 细胞株购于普如汀生物技术（北京）有限公司。

1.2 药物与试剂木犀草素（纯度为98%，批号20180112） 购自大连美仑生物技术公司；DMEM 培养基（批号64017510）、胎牛血清（批号1616626） 购自美国Gibco 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号SHBB5 172 V） 购自美国Sigma 公司；AG490（批号20170524）、MTT（批号20180121） 购自北京索莱宝科技有限公司；JAK2 抗体（货号ab108596，批号GR171114-1）、p-JAK2 抗 体（货 号ab32101，批号 GR171514-2 ）、STAT3 抗 体（货 号ab119352，批号 GR171514-2）、p-STAT3 抗 体（货 号ab76315，批号GR161326-2）、BAX 抗体（货号ab32503，批号GR88385-2）、BCL-2 抗 体（货 号ab185002，批号GR161516-2），辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG（H ＋L）（货号ab205718，批号GR84261-1） 均购自英国Abcam公司。

1.3 仪器 化学发光凝胶成像系统（ChemiDoc MP，美国Bio-Rad 公司）；水平摇床（WD-9405B，北京六一仪器有限公司）；转移槽（DYCZ-40D，北京六一仪器有限公司）；双垂直蛋白电泳仪（DYCZ-24DN，北京六一仪器有限公司）；CO2培养箱（HF-90，上海力申科学仪器有限公）；酶标仪（ELX-800，美国Bio-Tek 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 人宫颈癌Hela 细胞培养于含有10% 胎牛血清和1% 链霉素和青霉素双抗液DMEM 培养液中，于37℃、5% CO2恒温恒湿培养箱中常规培养，每2～3 天用胰酶消化，进行传代。

2.2 药物处理 将对数生长期Hela 细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，加入10、20、30、40 μmol／L 木犀草素或DMEM 继续培养24 h。根据上述实验，分组为对照组、木犀草素10 μmol／L组、木犀草素20 μmol／L组、木犀草素30 μmol／L组、木犀草素40 μmol／L组。根据木犀草素对Hela 细胞增殖和凋亡影响的结果，选择最适木犀草素浓度进行后续实验。选用JAK2 抑制剂AG490（40 μmol／L）处理Hela 细胞，培养24 h 后，进行后续实验。

2.3 Western blot 检测 收集各组Hela 细胞于离心管中，加入RIPA 裂解液，电动匀浆器进行裂解，BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。上样量为20 μg 蛋白质，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转印至PVDF 膜上，用PBS 清洗PVDF 膜5 min，加入5%脱脂奶粉封闭1 h。加入JAK2抗体（1∶2 000）、p-JAK2 抗体（1∶2 500）、STAT3 抗体（1∶2 000）、p-STAT3 抗体（1∶2 500）、Bax 抗体（1∶2 000）、Bcl-2 抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜。加入二抗（1∶2 500），37℃孵育1 h。二抗孵育后使用ECL 发光液处理，在暗室中进行曝光拍照。每组实验重复3 次。

2.4 MTT 检测 96 孔板每孔加入合适数量的细胞，药物处理24 h，将药物处理后的各组细胞的培养液移除并用PBS 清洗3 次。各组细胞中添加5 mg／mL MTT，并在37℃培养4 h，终止培养，移除培养液，加入200 μL DMSO 溶液来溶解沉淀。酶标仪测定各组Hela 细胞在490 nm 处OD。每组实验重复5 次。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 将药物处理后的各组Hela细胞充分消化，PBS 清洗，收集至流式管。利用Binding Buffer（500 μL） 重悬细胞，并加入Annexin V-FITC（5 μL）轻轻混匀，随后加入Propidium Iodide（10 μL） 染料处理细胞，室温条件下避光孵育15 min。细胞经流式细胞仪进行检测。每组实验重复6 次。

2.6 统计学分析 利用Graphpad Prism 6 进行数据统计学分析及数据作图。数据以（） 表示，多组间比较采用方差分析。以P≤0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 木犀草素对宫颈癌Hela 细胞增殖的影响 MTT 检测发现，木犀草素（30、40 μmol／L） 处理24 h 后可抑制Hela 细胞的增殖（P＜0.01），呈剂量依赖性；且40 μmol／L木犀草素处理Hela 细胞的存活率最低，见图1。

图1 不同浓度木犀草素对Hela 细胞增殖的影响

3.2 木犀草素对Hela 细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，对照组Hela 细胞凋亡率是4.2%，10、20、30、40 μmol／L 木犀草素处理24 h 后，Hela 细胞凋亡率分别是5.9%、11.5%、18.7%、24%；与对照组比较，木犀草素（30、40 μmol／L） 可以促进Hela 细胞凋亡（P＜0.01），见图2。结合40 μmol／L 木犀草素对Hela 细胞增殖的调控作用，选择40 μmol／L 木犀草素处理细胞，进行后续实验。

3.3 木犀草素抑制Hela 细胞JAK2、STAT3 磷酸化激活 Western blot 结果显示，40 μmol／L 木犀草素处理24 h后，Hela 细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达降低；JAK2 抑制剂AG490（40 μmol／L） 处理24 h 后，Hela 细胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表达也降低；当木犀草素与AG490 共同处理Hela 细胞后，p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达更低，见图3。提示，在Hela 细胞中，木犀草素可抑制JAK2、STAT3 磷酸化激活。

3.4 木犀草素通过JAK2／STAT3 信号通路调控Hela 细胞的增殖和凋亡 经40 μmol／L 木犀草素、JAK2 抑制剂AG490处理Hela 细胞24 h 后，Hela 细胞增殖受到抑制（P＜0.01），Bax 蛋白表达增加，Bcl-2 蛋白表达下降；当木犀草素与AG490 共同处理Hela 细胞后，Hela 细胞增殖抑制作用更强，Bax 蛋白表达更高，Bcl-2 蛋白表达更低。见图4。

4 讨论

宫颈癌是全球第二常见的女性癌症，每年导致260 000位女性死亡［5］。近年来，对宫颈癌的病因、治疗手段的研究已成为热点。侵袭转移是宫颈癌治疗过程中难以攻克的问题之一。

图3 木犀草素对Hela 细胞p-JAK2、p-STAT3 表达的影响

目前，黄酮类化合物治疗宫颈癌细胞侵袭已有部分研究［6-7］，但其内在机制尚需进一步研究。木犀草素作为黄酮类化合物家族中的一员，广泛存在于各种水果和蔬菜中，已被证实有多种药理功能，包括抗氧化、抗恶性细胞增殖［8-10］。研究［6］表明，木犀草素可以通过逆转上皮-间质转化（EMT） 信号，抑制宫颈癌细胞的侵袭能力。木犀草素可与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL） 协同作用，促进宫颈癌Hela 细胞凋亡［11］。尽管如此，木犀草素在治疗宫颈癌中的作用和机制尚未完全明确。刘鑫鑫等［12］研究表明木犀草素对宫颈癌Hela 细胞的增殖具有抑制作用，细胞在显微镜下呈现出明显的凋亡形态，但具体机制并未进行深入研究。

STAT3 作为JAK／STAT 信号通路中重要的信号分子，具有介导多种细胞因子的作用，在肿瘤组织和细胞中其呈高水平激活状态，进而对肿瘤细胞的增殖和凋亡等过程具有关键的调控作用［13］。有研究［14］表明，木犀草素在多种癌细胞中通过激活JAK1／STAT1／2 信号通路来调控干扰素α／β 发挥抗肿瘤增殖作用。然而，多个研究表明木犀草素可以抑制STAT3 的信号激活调控多种癌细胞的增殖和凋亡，如胰腺癌细胞［15］、胃癌细胞［16］、肺腺癌［17］等。目前，已有多个研究表明，宫颈癌的治疗过程中，抑制STAT3 信号通路，有效抑制宫颈癌细胞的增殖，促进宫颈癌细胞的凋亡［18］。目前，木犀草素在宫颈癌细胞中的调控是否通过JAK2／STAT3 信号通路尚未有研究。

在本研究中，探究了木犀草素对宫颈癌Hela 细胞的增殖能力及凋亡的影响及其潜在作用机制。木犀草素处理Hela 细胞24 h，木犀草素显著抑制Hela 细胞的增殖，与刘鑫鑫等［12］研究结果一致，同时证明木犀草素显著促进Hela细胞凋亡，且呈现剂量依赖 性。本实验中，p-JAK2、p-STAT3在Hela 细胞中呈高表达，JAK2 特异性抑制剂AG490 显著抑制p-JAK2、p-STAT3 的表达，且AG490 处理可以抑制Hela 细胞的增殖，促进Hela 细胞的凋亡，说明Hela 细胞的增殖及凋亡受JAK2／STAT3 信号通路的调控。对比AG490 处理组，木犀草素与AG490 共同处理Hela 细胞，对Hela 细胞增殖能力及凋亡调控更加显著。实验结果表明木犀草素在宫颈癌Hela 细胞中抑制JAK2／STAT3 信号通路，进而调控Hela 细胞的增殖及凋亡。

图4 木犀草素通过JAK2／STAT3 信号通路调控Hela 细胞的增殖和凋亡

综上所述，本研究证明了木犀草素通过调控JAK2／STAT3 信号通路的激活，抑制宫颈癌Hela 细胞增殖，促进宫颈癌Hela 细胞凋亡。