鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导关节软骨细胞炎症反应的影响

史桂荣 任博文 杜旭召 张啟威 史栋梁*

（1.商丘医学高等专科学校， 河南 商丘476100； 2.河南省中医院骨病一科， 河南 郑州450002）

中医药在中国和亚洲其他国家已经使用了数千年，可用于各种疾病的防治且副作用很小。鸡屎藤Paederia scandens（Lour.） Merr 是一种茜草科植物，主要分布于我国的长江中下游及以南各省。鸡屎藤在中国、日本、韩国等地有着悠久的药用历史，广泛用于缓解疼痛、炎症等症状。研究表明，环烯醚萜及其相关的环烯醚萜苷化合物（鸡屎藤苷、车叶草苷、鸡屎藤苷酸等） 是鸡屎藤主要的药理活性成分［1］。

骨关节炎（OA） 是滑膜关节的一种渐进性疾病，在许多老年人中导致进行性疼痛，但除了止痛药物和物理治疗外，目前还没有特别有效的治疗OA 的药物，这些药物的疗效有限。随着对OA 病理的日益清楚的了解，迫切需要获得一种有效的内源性修复药物，减缓OA 的进程。本研究旨在通过体外实验探讨鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导关节软骨细胞增殖和炎症反应的影响及其相关机制。

1 材料

1.1 细胞株 人关节软骨细胞（CH8 细胞） 购自中国科学研究院。

1.2 药物与试剂 鸡屎藤苷酸（paederosidic acid，PA，批号B20585，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；DMEM／F12 培养液、胎牛血清（美国Gibco 公司）；MTT 溶液（美国Sigma 公司）；ELISA 试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；PrimeScript RT reagent 试剂盒［宝日医生物技术（北京） 有限公司］；兔抗MMP-3、MMP-13、p-p65、p65、p-IκBα、IκBα 抗体（美国Cell signaling 公司）；IgG-辣根过氧化物酶（HRP） 标记的羊抗兔二抗（美国Invitrogen 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 将人关节软骨细胞（CH8 细胞） 接种于含10%胎牛血清的DMEM／F12 培养基，37℃、5% CO2培养箱内进行培养。当细胞铺满瓶底80%时，进行传代，取第2 代软骨细胞进行后续实验。

2.2 软骨细胞炎症造模 取对数期细胞进行培养，待细胞长至80%融合时，加入含IL-1β（10 ng／mL） 的DMEM／F12培养液处理CH8 细胞24 h［2］。

2.3 MTT 检测CH8 细胞增殖 将CH8 细胞以1×104／孔的浓度接种于96 孔板，加入10、20、40、80、150 μg／mL 鸡屎藤苷酸处理24 h；对照组只含DMEM／F12 培养液，加入MTT 溶液（5 mg／mL） 37℃孵育4 h，随后在室温条件下与二甲基亚砜共同孵育10 min，在酶标仪上测定其在570 nm处的吸光度值（OD）。加入含IL-1β（10 ng／mL） 的DMEM／F12 培养液处理CH8 细胞24 h，加入10、20、40、80、150 μg／mL 鸡屎藤苷酸处理24 h，按上述MTT 方法，测定在570 nm 处的吸光度值（OD）。

2.4 ELISA 检测NO 水平 将CH8 细胞以1×105／孔的浓度接种于6 孔板，加入含IL-1β（10 ng／mL） 的DMEM／F12培养液处理CH8 细胞24 h，加入10、20、40、80 μg／mL鸡屎藤苷酸处理24 h，收集的细胞培养上清液。采用ELISA 试剂盒，按说明书测定培养基中NO 的水平。

2.5 RT-PCR 检 测 CH8 细 胞MMP-3、MMP-13、iNOsmRNA 表达 收集细胞，用TRIzol 试剂提取总RNA，用PrimeScript RT reagent 试剂盒将1μg 总RNA 逆转 录成cDNA。参照SYBR Green PCR Master Mix 构建20 μL 反应体系，于ABI Prism 7500 序列检测系统上进行反应检测。引物序列，MMP-3 正向5′-GGAGATGCTCACTTTGACGATG-3′，反向5′-CAGCAACCA GGAATAGGTTGG-3′；MMP-13正 向 5′-GGTCCCAAAC GAACTTAACTTACA-3′，反 向 5′-CCTTGAACGTCATCATCAGGAAGC-3′ ；iNOs正 向5′-CCTCAAGCTATCGAATTTGTC-3′，反 向 15′-TTGCCATTGTT GGTGGAGTA-3′；β-actin正向5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，反向5′-CTCATAGCTCTTCTCCAGGGAGGA-3′。

2.6 Western blot 检测蛋白表达 收集细胞，用冷冻PBS 洗涤2 次后加入裂解缓冲液进行超声处理，4℃、10 000 r／min离心10 min 收集上清液。BCA 蛋白试剂盒测定细胞上清液的蛋白质浓度。取30 μg 蛋白经SDS-PAGE 分离后，转移到PVDF 膜。用5% 脱脂乳于常温下封闭1 h，加入抗体MMP-3、MMP-13、p-p65、p65、p-IκBα、IκBα、β-actin，4℃孵育过夜。用TBST 洗涤后，加入IgG-辣根过氧化物酶（HRP） 标记的二抗室温孵育1 h。用增强化学发光法（ECL） 检测免疫反应，以β-actin 为内参作对照。

2.7 统计学分析 采用SPSS21.0 软件进行统计分析，数据以（） 表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞增殖的影响 单独处理CH8 细胞24 h，不同浓度鸡屎藤苷酸（10、20、40、80、150 μg／mL） 促进CH8 细胞增殖（P＜0.05），无细胞毒性。与对照组比较，IL-1β 诱导CH8 细胞24 h，CH8 细胞增殖抑制（P＜0.05），而鸡屎藤苷酸干预24 h，其能促进CH8 细胞增殖。见图1。

图1 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞增殖的影响

3.2 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞MMP-3、MMP-13蛋白表达的影响 如图2 所示，与对照组比较，IL-1β 诱导CH8 细胞上调MMP-3、MMP-13 蛋白及mRNA 表达（P＜0.05），而鸡屎藤苷酸干预后，抑制MMP-3、MMP-13 蛋白及mRNA 表达（P＜0.05）。

图2 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞MMP-3、MMP-13 蛋白表达的影响

3.3 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞NO 水平、iNOsmRNA 表达的影响 与对照组比较，IL-1β 诱导CH8 细胞产生NO，增加iNOSmRNA 表达（P＜0.05），而鸡屎藤苷酸则能抑制IL-1β 诱导CH8 细胞产生NO，降低iNOsmRNA表达（P＜0.05）。见图3。

3.4 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞p-p65、p-IκBα 蛋白表达的影响 NF-κB 是诱导软骨细胞iNOS 降解的重要调节因子。与对照组比较，IL-1β 诱导CH8 细胞促进p-p65、p-IκBα 表达（P＜0.05），而鸡屎藤苷酸能抑制IL-1β 诱导CH8 细胞p-p65、p-IκBα 表达上调（P＜0.05）。见图4。

4 讨论

图3 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞NO 水平、 iNOs mRNA 表达的影响

图4 鸡屎藤苷酸对IL-1β 诱导CH8 细胞p-p65、p-IκBα 蛋白表达的影响

鸡屎藤苷酸是从鸡屎藤中分离得到的一种有效成分，具有抗惊厥、镇静、抗炎、抗胃癌等药理作用［3-5］。然而，鸡屎藤苷酸在骨关节炎的作用迄今尚未见报道。骨关节炎的发生与老龄化、负重过大等过程有关，进而引发一系列的分子事件，导致关节软骨细胞死亡和结构损伤，尤其是炎症反应。大量研究表明，IL-1β 与OA 的严重程度呈正相关，且在颞下颌关节炎［6］、手骨关节炎［7］和膝关节炎［8］滑膜液中IL-1β 水平显著升高。OA 的发生发展与软骨细胞促炎细胞因子（IL-1β） 的产生密切相关。因此，本研究用IL-1β（10 ng／mL） 诱导人软骨CH8 细胞炎性损伤，以模拟OA 的体外模型，研究鸡屎藤苷酸在骨关节炎的作用。发现鸡屎藤苷酸可促进软骨细胞增殖，并下调MMP-3 和MMP-13表达，以及NO 和iNOs 表达。此外，鸡屎藤苷酸抑制IL-1β 激活的NF-κB 信号通路。

虽然对软骨损伤的分子生物学进行了广泛的研究，但至今还没有发现某个单一因素会导致软骨损伤［9］。在骨关节炎的发生过程中，滑膜释放炎症介质和细胞因子，软骨细胞活化后产生MMPs 和NO，这些分子进一步引起软骨结构改变［10］。骨关节炎的特点是细胞外基质（ECM） 大分子降解，软骨细胞蛋白表达降低，导致关节严重疼痛，运动能力丧失，进行性不可逆功能障碍，而MMPs 被认为是降解ECM 的关键分子。MMP-3 可通过激活各种MMPs 前体，如pro-MMP-1、pro-MMP-7、pro-MMP-8、pro-MMP-13，以及裂解细胞外成分等加重炎症反应［11］。MMP-13 可降解骨关节炎发展过程中的细胞外基质［12］。在本研究中，发现鸡屎藤苷酸明显降低MMP-3 和MMP-13 的蛋白表达，提示鸡屎藤苷酸可能通过下调MMP-3 和MMP-13 的表达，来调控IL-1β 处理的软骨细胞ECM 的降解。

在促炎因子中，NO 是一种具有快速和自发反应（与超氧阴离子反应） 的主要毒性物质，通过这种反应生成过氧亚硝酸和过氧亚硝酸阴离子。目前已鉴定出3 种形式的NOS，其中iNOS 除了被合成用于对炎症刺激的反应外，还能诱导高水平的NO 生成［13］。NO 是OA 发病过程中重要的炎症介质，前期的研究［14］发现iNOS 在IL-1β 诱导的软骨细胞可导致NO 的过度产生。本研究发现，鸡屎藤苷酸抑制IL-1β 刺激人软骨细胞NO 的产生和iNOS 的表达，表明鸡屎藤苷酸在IL-1β 诱导的关节软骨细胞抑制NO 的产生和iNOS 的表达。

炎症反应是导致ECM 降解的重要因素。多种炎症因子可触发IκBα 的磷酸化和降解，并将NF-κB 转运到细胞核，促进炎症蛋白合成和促炎分子（IL-6、TNF-α） 释放，导致软骨变性［14-15］。在非刺激条件下，NF-κB 二聚体与抑制蛋白IκB 结合后以非活性形式存在于胞浆中。在各种化学和机械信号刺激下，NF-κB 蛋白被活化，进而通过IκB 激酶使IκB 发生磷酸化［16］。在OA 中，软骨细胞表达多种NF-κB介导的分解性细胞因子和趋化因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 受体激活因子（RANKL）、IL-8 等，这些因子和趋化因子促进MMPs 的产生，抑制胶原和蛋白多糖的合成，并在一个正反馈回路中增强NF-κB 的活化［17］。蔡林奕等［18］研究表明，NF-κB 抑制剂bay11-7082 可显著降低经TNF-α 处理的软骨细胞中MMPs 的表达。此外，Liacini等［19］研究还表明在人软骨细胞中，NF-κB 抑制剂可抑制IL-1β诱导的MMP-3 和MMP-13 的产生。本研究发现鸡屎藤苷酸可抑制IL-1β 诱导CH8 细胞p-p65、p-IκBα 蛋白表达上调。

综上所述，鸡屎藤苷酸通过抑制人软骨细胞MAPK 和NF-κB 信号通路，抑制IL-1β 诱导的NO 产生，以及MMP-3、MMP-13、iNOS 的表达。鸡屎藤苷酸可能是进一步开发抗关节炎药物的理想候选药物。