基于网络药理学探讨茯苓治疗糖尿病肾病的研究

郭金铭 周 峰＃ 谭 洋 杨岩涛* 裴 刚

（1.湖南中医药大学药学院， 湖南 长沙410208； 2.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，湖南 长沙410208）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN），糖尿病肾脏病变，是一种以持续性蛋白尿和肾功能渐进性下降为临床特征的综合征［1］，常见于发生严重微血管病变的糖尿病患者中，是世界范围内导致终末期肾脏病的首要病因［2-4］。我国由于人口老龄化和糖尿病的高发病率，糖尿病肾病的患病人数正呈逐年上升的趋势［5］。

中医认为糖尿病归属于“消渴” 范畴，当进一步发展至糖尿病肾病时，其基本病机转化为脾肾两脏亏虚，痰、湿、瘀蕴结，日久不化而转为痰毒、湿毒甚至瘀毒，即脾肾亏虚、瘀毒内蕴［6-7］。因此，健脾固肾法常在临床上被用于糖尿病肾病的干预和治疗［8］。而茯苓作为中医治疗糖尿病肾病的常用药物之一，来源于多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.） Wolf 的干燥菌核，味甘、淡，药性平和，具有利水渗湿、健脾宁心的功效，主要用于治疗浮肿少尿、头晕心悸、脾胃虚弱、便溏腹泻、焦虑失眠等［9］。现代药理研究［10-12］表明，茯苓具有抗纤维化、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、调节免疫等多种作用。虽然茯苓治疗糖尿病肾病的临床疗效比较明确［13］，但存在作用分子机制不明确的问题，仍需要进一步研究探索。

网络药理学是一种基于系统生物学和经典药理学等各学科理论，多角度分析药物干预疾病作用靶点及机制的系统方法［14-15］。合理利用网络药理学研究中药的作用靶点及机制，契合中医药的整体观念，且结果可信度较高。已有学者通过网络药理学方法研究二至丸对肾脏保护作用机制［16］、虎杖治疗结直肠癌作用机制［17］、厚朴抗抑郁的物质基础及其作用机制［18］。茯苓的化学成分主要包括多糖类、三萜类、甾醇类［19］，这些成分的药理活性较为广泛，且作用靶点丰富［20］，网络药理学的方法研究茯苓治疗糖尿病肾病的作用靶点和机制。

本研究通过TCMSP、DRUGBANK、SWISS、STITCH 等数据库，首先获得中药茯苓的12个主要活性成分及其预测的作用靶点，并结合TTD、DRUGBANK、OMIM 数据库所包含的糖尿病肾病的疾病相关靶点，同时应用可视化软件Cytoscape 3.7.1 构建了“成分-靶点-疾病” 的交互网络。最终根据DAVID 信号通路富集分析茯苓治疗糖尿病肾病的潜在作用机制，为阐明茯苓治疗糖尿病肾病的物质基础、作用靶点及机制提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 网络工具汇总 如表1 所示，全文涉及的数据库与软件。

表1 本文献所涉及的数据库与软件

1.2 茯苓活性成分的查找及筛选 将“茯苓” 作为检索词条，运用TCMSP 数据库获得其包含的已知化学成分，基于OB≥30%［21-22］和DL≥0.18［23-24］2 项筛选原则，得到茯苓的活性成分。并在PubChem 数据库中获取这些成分的SMILE 式。

1.3 茯苓活性成分作用靶点和糖尿病肾病相关靶点的预测 将活性成分的SMILE 式输入SWISS 数据库中获取其作用靶点，并将TCMSP 数据库和STITCH 数据库所预测的靶点同时纳入研究，经过去重整合后，将靶点名称输入UniProt 数据库，获得其相应靶点的人源的靶点基因名称及其ID。在TTD、DRUGBANK、OMIM 数据库中，以“diabetic nephropathy” 为关键词对糖尿病肾病相关靶点进行检索。

1.4 茯苓活性成分-作用靶点网络的建立 将依据“1.3”项整合的茯苓12个“活性成分” 及其“可能作用靶点”分列输入Excel 表格中，把它们当作两类节点（node），如若具有相关性则用边（edge） 连接。采用Cytoscape 3.7.1软件，构建中药茯苓“活性成分-作用靶点” 的交互作用网络图。

1.5 茯苓活性成分-靶点-糖尿病肾病网络分析与建立 将已经去重整合获得的茯苓活性成分的作用靶点和糖尿病肾病关联靶点输入String 数据库，选定物种为人，进行蛋白互作分析。将从String 数据库导出的蛋白互作分析结果（tsv 格式） 导入Cytoscape 软件直接获取相互作用网络。接着通过该软件自带的Tools 分析功能，得到上述网络关系中的度值（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC） 等数值，确立DC 大于所有节点DC 中位数2 倍的节点为关键靶点［25］，并在上述网络图中将其归属到成分靶点、疾病靶点和其他类别。同时打开“1.4” 项下建立的茯苓活性成分-作用靶点网络，点击Cytoscape 软件的关联（Merge） 功能键输出模型，形成最终的“茯苓活性成分-靶点-糖尿病肾病” 网络图。

1.6 生物过程与通路分析 在DAVID 数据库中输入茯苓与糖尿病肾病相关的关键靶点基因，选定物种为人，对上述靶点进行基因本体论（GO） 分析（生物过程BP、分子功能MF、和细胞组成CC） 和KEGG 通路富集分析，下载分析结果。对P值（设定阈值P＜0.01） 从小到大进行排序，汇集排在前十名的生物过程或通路，用GraphPad Prism 7.0 绘图后，进行解析说明。

2 结果

2.1 茯苓活性成分的汇集和筛选 本研究依托TCMSP 平台检索茯苓的化学成分，共获得34个化合物。经由OB、DL 值筛选得到化合物15个，删除尚未找到作用靶点的化合物3个，最终得到活性成分12个，见表2。

表2 茯苓经OB 和DL 筛选所得12个化合物信息

2.2 茯苓活性成分作用靶点和糖尿病肾病相关靶点的预测 在TCMSP、SWISS、STITCH 数据库中，输入上述12个茯苓活性化合物进行检索，以预测其作用靶点，剔除重复的靶点，得到作用靶点共计279个。通过检索TTD、DRUGBANK、OMIM 等多个与疾病相关的数据库，共得到46个与糖尿病肾病发生、发展具有紧密关联的已知靶点基因。

2.3 茯苓活性成分-作用靶点网络构建 在Cytoscape 界面中初步建立茯苓活性成分-作用靶点网络图（图1）。据软件统计分析共有291个节点，84 390 条边，其中正方形代表茯苓的活性成分，圆形代表其作用靶点。多个茯苓活性成分均可作用于多个不同的靶点；从而反映出茯苓多成分、多靶点协同治疗的特点。

图1 茯苓活性成分-作用靶点网络图

2.4 茯苓活性成分-靶点-糖尿病肾病网络分析与建立 通过计算每个蛋白的拓扑性质寻找茯苓治疗糖尿病肾病作用的关键靶点，最后获得42个DC≥36（即2 倍DC 中位数）的节点作为主要节点，绘制其互作图（图2），其中圆形表示活性成分作用靶点，三角形表示糖尿病肾病疾病相关靶点，菱形表示共同靶点，正方形表示活性成分。

2.5 生物过程与通路分析 生物过程分析中可以看出，靶点主要涉及蛋白质磷酸化、发热、NO 生物合成、胞质Ca2＋浓度的正向调控过程、磷脂酶C 激活G 蛋白偶联受体信号通路、痛觉产生和感知过程、多种应答过程（脂多糖反应、吗啡反应、免疫反应）、脂多糖介导的信号传导途径等生物过程。分子功能分析中可以看出，靶点具备能和酶（磷脂酰肌醇磷脂酶C 等）、激酶（MAP 激酶等）、类固醇、类固醇激素受体、神经肽、药物、型血管紧张素受体等结合的分子功能。细胞组成分析中可以看出，靶点主要分布于细胞膜（membrane）、质膜（plasma membrane）、核内体（endosome）、神经元胞体（perikaryon）、轴突末端（axon terminus）、树突（dendrite） 等。见图3～4。

通过对茯苓治疗糖尿病肾病的42个关键靶点进行KEGG 通路富集分析，得到41 条主要的生物信号通路，按P值由小到大排序选取与糖尿病肾病相关的通路10 条（表3），说明茯苓活性成分治疗糖尿病肾病的作用靶点分布在不同的代谢通路。

3 讨论

图2 茯苓活性成分-靶点-糖尿病肾病关键靶点之间的相互作用网络

图3 茯苓活性成分治疗糖尿病肾病的GO 分析-柱状图

图4 茯苓活性成分治疗糖尿病肾病的GO 分析-气泡图

表3 茯苓活性成分治疗糖尿病肾病的KEGG 通路分析

糖尿病肾病发病因素（如遗传因素、自身免疫性疾病、病毒感染、药物等） 复杂，涉及多种机制之间的相互作用，包括微循环障碍、糖代谢或脂代谢异常、氧化应激、内质网应激、自噬及炎症反应等［26-27］。肾小球、肾小管等结构在其疾病发展过程中也会发生病理学特征性改变［28］。目前临床上西医对于糖尿病肾病的治疗仍以对症治疗为主，如调节血压、血糖、血脂，选用的药物通常受到限制且常伴有不良反应［29］；而茯苓作为健脾益肾之佳品，以其为主要药物的中药复方因其独特的疗效和多成分、多靶点及多途径的作用特点，在糖尿病肾病的治疗中占据重要地位；然而茯苓是通过何种途径、何种机制抗糖尿病肾病尚不清楚［30］。网络药理学多角度系统分析规律与中医整体观念的用药原则基本一致，有助于系统地阐释茯苓治疗糖尿病肾病的复杂作用机制［31］。

本研究以TCMSP 数据库筛选所得12 种活性成分（主要分为三萜类、甾醇类） 为基础，构建了茯苓“活性成分-作用靶点” 网络图，体现了茯苓发挥治疗作用的成分多样、靶点丰富的优势；而茯苓“活性成分-靶点-糖尿病肾病” 靶点互作图在一定程度上反映出它们之间存在复杂交错的相互关系，并非独自发挥作用。本研究结果显示，氢化松苓酸，啤酒甾醇，常春藤皂苷元，去氢齿孔酸连接靶点数量较多，在一定程度上推测它们是茯苓发挥治疗糖尿病肾病作用的主要活性成分。而MAPK3、IL-6、APP、TNF、PTGS2、MAPK8、IL-1β、AGTR1 等度值较大，是茯苓活性成分的主要作用靶点；其中IL-1β、IL-6 和TNF 作为炎性因子，通过多种途径参与了糖尿病肾病的发生和发展［32］，例如肾脏内炎性细胞过度表达的TNF-α，不仅让糖尿病患者肾小球微血管通透性得到加强，继而出现糖尿病肾病的明显病理特征—蛋白尿；还能加快其肾小管上皮细胞的凋亡进程，导致患者肾脏早期损伤和肾纤维化［33-34］。现有体内外实验［35］表明，茯苓酸作为茯苓的代表化合物之一，不仅能够通过下调心肌细胞IL-1、IL-6、TNF-α 等炎症介质的表达，发挥其抗炎作用［20］，还能通过增强胰岛素敏感性显著降低糖尿病小鼠的餐后血糖水平［36］；甚至能通过减少小鼠细胞外基质形成相关蛋白及mRNA 表达，减轻肾脏组织损伤，从而达到保护肾脏的目的［37］。因而为茯苓治疗糖尿病肾病的靶点预测提供实验支持。

由GO 分析结果推测，茯苓治疗糖尿病肾病涉及到代谢和细胞应激等生物过程，有细胞膜、质膜、核、轴突、树突等细胞组分的密切参与，主要结合酶、受体、蛋白质等各种物质，并且实际的过程远较本文所预测的结果复杂。而从KEGG 通路分析中可以看出，茯苓治疗糖尿病肾病涉及多条复杂的信号通路。NOD 样受体和Toll 样受体通路作为激活固有免疫的重要信号通路［38］，在受到配体刺激后能传递信号触发机体炎性反应，促使炎性细胞浸润和炎症因子过度表达，因此预测两个通路在启动和调节免疫系统中起重要作用［39］。叉头转录因子（forkhead box O，FoxO） 可在转录和传递大量生长因子及细胞因子信号的同时，调节下游的靶基因表达，继而达到调控细胞增殖、凋亡、自噬、氧化应激和免疫反应的目的。其中FoxO1 的激活能够抑制处于高糖状态下的上皮细胞间充质转化，改善糖尿病小鼠“蛋白尿” 的病理特征及减轻肾脏损害。越来越多的研究表明，FoxO1 对机体内许多重要的信号转导途径（如PI3K／Akt 信号通路） 发挥了重要的生物学效应。PI3K／Akt信号通路是FoxO1 蛋白的直接上游，不仅可使FoxO1 蛋白的转录活性随着氨基酸残基的磷酸化修饰、亚细胞定位、DNA 结合位点等的变化而发生改变；还参与了足细胞的生长、分化、凋亡过程［40-41］。VEGF 作为一种血管内皮生成因子，能够维持正常的血管密度及通透性。一般情况下，机体内VEGF 的表达很低，但在肾脏受到损伤时，VEGF 表达升高，最终加速血管生成。大量研究表明［42-43］，降低VEGF 的表达、抑制VEGF 与其受体结合或者阻断其下游信号等途径均可在一定程度上抑制糖尿病肾病等微血管并发症的发展过程。综上所述，本研究结果显示茯苓12个活性化合物可能作用于279个靶点，关系到多种过程、分子和通路，虽然体现了茯苓成分多样-靶点丰富-途径复杂的起效特点，但不足的是茯苓多糖类成分由于OB 值和DL 值较低且应用该类成分的单体化合物治疗疾病研究较少，故未能纳入研究中［44］。虽然本研究已经通过String 网站预测了茯苓治疗糖尿病肾病作用的42个关键靶蛋白，并对其进行生物过程与通路分析，但仍应对相关靶点进行进一步的实验验证。