王文静 赵旭 甄航勇 钱宝
摘要:分光光度法在我国水环境监测领域应用广泛,但在分析批量样品时需投入大量人力物力,成本较高。利用酶标仪微量比色法,提出了一种对微量、批量样品的快速测定方法。以水中氨氮检测为例,确定了该方法的最佳参数和条件,并与传统的分光光度法进行比较。酶标仪微量比色法与分光光度法在线性范围、检出限、最低检出限、灵敏度等分析参数上没有明显差异。通过对实验条件的优化,酶标仪微量比色法测定氨氮仅需样品体积200 μL,纳氏试剂4μL,1 min内可以完成96个样品的测定,弥补了分光光度法在批量操作上的不足,减少了实验废水的排放,使分析检测工作快速、准确和省时。
关键词:酶标仪微量比色法;分光光度法;微量测定;氨氮检测;水环境监测
中图法分类号:X832
文献标志码:A
DOI: 10.15974/j.cnki.slsdkb.2020.05.012
1 研究背景
分光光度法是一种历史悠久的经典水环境监测方法,因其设备简单、操作方便,且具有较好的灵敏度和选择性,在水质检测中应用较为广泛。分光光度法也是国标中常见的推荐方法之一,如纳氏试剂分光光度法测定氨氮、二苯碳酰二肼分光光度法测定六价铬、钼酸铵分光光度法测定总磷等。然而,在批量样品分析时,分光光度法需投人大量的人力物力。因此,开展分析试剂减量研究、提高批量操作效率,是实现快速、准确、省时和绿色分析检测工作的需要[1]。
酶标仪是测定酶联免疫反应的一般仪器,其原理与分光光度法类似,能够进行微量检测和批量操作,极大地节省时间且操作方法简便,检测成本低廉[2]。酶标仪主要应用于生物医药检测方面[3],在水质检测领域的应用报道较少。范鹏等[4]分别用紫外分光光度计与酶标仪测定盐酸川穹嗪的含量,结果显示两种方法对盐酸川穹嗪的测定结果没有显著差异。苏敏等[5]建立了酶标仪测定饮用水中铝的分析方法,能用于生活饮用水等常规水质分析中铝的测定。杨帆等[6]分别采用分光光度法和酶标仪微量法测量发酵菌液浓度,结果表明两种方法测量的结果无显著性差异(t=0.02)。
本研究以水质检测中常见的纳氏试剂分光光度法( HJ 535-2009)为例,将酶标仪推广用于分光光度法,提出一种对微量、批量样品的优化测定方法,实现对水中氨氮的快速检测。通过考察样品体积、显色时间、显色方式等对微量测定的影响,比较了酶标仪微量比色法与分光光度法测定结果的差异,在此基础上分析得到环境水样的氨氮浓度。该方法试剂用量少、可以实现快速批量测定,以较低的成本来弥补分光光度法在批量测定上的不足,以期为水中氨氮检测提供更好的方法。
2 材料与方法
2.1 儀器与试剂
实验仪器包括:K3型酶标仪(LabServ,USA),为8通道垂直光路光密度检测仪,测量波长范围为基金项目:湖北省自然科学基金资助项目(2017CFB312)400 - 750 nm;可见分光光度计(T6新悦,北京普析通用仪器有限责任公司),光学系统为双光束比例监测,测量波长范围为325 -1 100 nm;96孔微孔板(Thermo,USA)。
实验试剂包括:氨氮标准使用液(10mg/L);酒石酸钾钠溶液(500 g/L);Hgl:-KI-NaOH溶液(HJ535-2009)。所用试剂均为分析纯,实验用水为三级纯水。
2.2 样品来源
标准样品采用有证标准物质配制。氨氮环境水样选取汉江(襄阳余家湖)和唐白河(襄阳唐白河口)2条污染情况不同的河流,样品编号为S1、S2。
2.3 标准系列制备
分光光度法分别移取0.00,0.50,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00 mL和10.00 mL氨氮标准使用液于50 mL具塞刻度管中,加水至50 mL,按照标准方法进行测定。酶标仪微量比色法对应取0,2,4,8,16,24,32 μL和40 μL氨氮标准使用液于96孔微孔板中,加水至200μL,对应的氨氮含量与分光光度法一致。绘制不同样品体积的标准曲线时,对应按比例移取氨氮标准使用液。
2.4 实验方法
纳氏试剂分光光度法测定采用标准方法(HJ535-2009)。加入1.0 mL 500 g/L酒石酸钾钠溶液摇匀,再加入纳氏试剂1.0 mL摇匀。室温下放置10 min后,使用光程为20 mm比色皿,在420 nm波长下以水做参比,测定吸光度。酶标仪微量比色法对应加入4μL酒石酸钾钠溶液、4μL纳氏试剂,在优化条件下显色后,于420 nm波长处测定光密度(OD)值。绘制不同样品体积的标准曲线时,对应按比例移取酒石酸钾钠溶液和纳氏试剂。酶标仪微量比色法实验中所用溶液均为配置后使用移液枪移取。
2.5 数据处理
进行样品测定前,以空气为参比,对96孔微孔板进行测定,连续两次测定的差值应小于0.002。测定样品时,每个板保留一个空白样,每批样品连续测定两次取平均值,扣除空白后参与浓度计算。
使用线性范围、检出限、最低检测限、精密度和灵敏度分析参数优化后的结果;线性范围是通过测定标准溶液的最低和最高浓度来确定;检出限为3倍空白水样的标准偏差;最低检测限为检出限的4倍;精密度用相对标准偏差表示;灵敏度用校准曲线的斜率表示[7-8];准确度用加标回收率来表示。
3 结果与讨论
3.1 实验参数优化
样品体积、显色方式、显色时间等是影响酶标仪微量测定的重要参数,实验对其逐一进行优化。纳氏试剂分光光度法测定氨氮显色的最佳温度为20C-25℃[9-10],本研究在室温下操作,不再进行显色温度的优化。
3.1.1 样品体积
酶标仪的光源从微孔板底部透射,加样量应满铺微孔底部,同时不能溢出微孔[11]。用Therm0 96孔微孔板工作体积为50-250 μL,设置50,100,150,200μL和250 μL这5个样品体积梯度。图1为相同浓度氨氮标准序列样品在不同样品体积梯度下的标准曲线。不同体积样品绘制的曲线相关系数均可达到0.995以上。随着样品量的增加,同一浓度样品的光密度逐渐增大,标准曲线斜率也逐渐增大。标准曲线斜率对标准样品的检测值计算有比较明显的影响[12]。
对已知浓度为0.540+0.027 mg/L的氨氮标准样品(BW085515 160957)进行测定,测定结果见表1。对于氨氮样品,当样品体积为50 μL时,测定结果不准确;当样品体积为100 μL时,测定结果合格,但与标准值相对误差较大;当样品体积达到150 μL及以上时,测定结果较好。综合考虑灵敏度、准确度以及操作的便捷性,氨氮样品体积取200 μL为宜。
3.1.2 显色方式
纳氏试剂分光光度法测定氨氮,摇匀后静置10mm即可进行测定。由于96孔微孔板反应室体积小,酶标仪微量比色法溶液组分之间不易交换,借助振荡等手段可以消除气泡,快速将溶液摇匀[11-13]。通过对比振荡10 s后静置显色和保持振荡显色可以看出(见图2),两者显色完成度基本一致,但静置显色的测定结果的平行性明显较差,这可能是静置条件容易造成显色不均匀。
3.1.3 显色时间
纳氏试剂分光光度法在10 -30 min显色较稳定,40 min以后逐渐褪色,光密度值逐渐降低[14-15]。图3为不同时间条件下酶标仪微量比色法的标准曲线斜率。随着振荡时间的增加,同一浓度溶液显色后的光密度值呈逐渐增大趋势,曲线斜率呈上升的趋势。对于氨氮测定来说,在10 min后光密度值基本达到稳定且线性较好,说明10 min显色基本完成。
与传分光光度法显色时间相比,酶标仪微量比色法显色在时间上没有明显优势,但酶标仪可以在1 min内同时测定96个样品,减少了繁琐更换和清洗比色皿等工作[16],且提高了测定效率,节约了分析时间。
3.2 与分光光度法的对比
3.2.1 线性及灵敏度比对
本研究采用的酶标仪微量比色法与传统的分光光度法相比,一次性分析样品数量为96个,所需样品体积不超过250 μL。每个样品氨氮测定消耗纳氏试剂体积仅为4 μL。微量比色法可以大幅度提高分析效率,节约试剂成本。在优化实验条件下,用酶标仪微量测定法重复空白实验9次,计算检出限。两种方法的参数比对见表2。酶标仪在批量分析微量体积样品时优势明显,且线性范围、检出限、最低检出限、灵敏度等分析参数没有明显差异。酶标仪微量比色法测定水中氨氮的方法经过参数优化后,可以满足分析试剂减量、提高批量操作效率的需求。
3.2.2 环境水样及准确度比对
分别用酶标仪微量比色法和分光光度法对采取的环境水样进行测定,每组水样取7个平行样进行测定,测定结果见表3。取10 μL浓度为10 mg/L的氨氮标准溶液加入水中,计算加标回收率。酶标仪微量比色法和分光光度法测定环境水样的结果一致性较好,酶标仪微量比色法测定的加标回收率符合要求。
4 结语
本文采用酶标仪微量比色法测定氨氮,标准曲线分别移取0,2,4,8,16,24,32μL和40μL氨氮标准使用液于96孔微孔板中,加水至200 μL;环境水样取200 μL样品于96孔微孔板中。依次加入4μL酒石酸钾钠溶液、4μL纳氏试剂,室温下振荡显色10min,于420 nm波长处用酶标仪测定光密度,减去空白值后,根据标准曲线换算成样品浓度。
采用酶标仪微量比色法测定水中氨氮,其线性范围、检出限、最低检出限、灵敏度等分析参数与纳氏试剂分光光度法没有明显差异。酶标仪在批量分析微量体积样品时优势明显。
酶标仪微量比色法在分析大批量样品时具有明显优势,可满足分析检测工作的需要,同时可明显减少分析试剂尤其是有毒实验废液的排放,有效减轻二次污染。此外,本研究方法可以拓展到其他比色法测定项目,为水质检测提供新的技术方法。
参考文献:
[1]封跃鹏,邱赫男,孙自杰,纳氏试剂分光光度法测定水中氨氮研究进展[J].环境科学与技术,2016,39(S2):348-352.
[2]杨帆,李淑梅,杨晓,等.分光光度法与酶标仪微量法测量菌液浓度的比较[J].光谱实验室,2011,28(4):752-1754。
[3] 石耀强,张晗依,刘双月,酶标仪检测技术应用的研究进展[J].科技展望,2016(24):73.
[4]范鹏,蒋林东,王小丹,等.紫外分光光度计与酶标仪测定盐酸川芎嗪含量的比较[J].西南国防医药,2010,20(7):720-722.
[5]苏敏,罗小琴,王定国.酶标仪微量试剂法测定饮用水中铝的方法研究[J"职业卫生与病伤,2015,30(5):315-316.
[6]杨帆,李淑梅,杨晓,等.分光光度法与酶标仪微量法测量菌液浓度的比较[J].光谱实验室,2011,28(4):1752-1754.
[7]刘丽君,张秀忠,陆坤明.水质分析中的检出限及其确定方法[J].净水技术,2003,22(1):37-39.
[8] 孙宝盛.环境分析监测理论与技术[M].北京:化学工业出版社,2004.
[9] 陈金凤.分光光度法测定水体中氨氮实验条件影响分析[J].广东化工,2015,42(14):222-223.
[10] 李凤彩,李冰,陈界江,显色条件对纳氏试剂分光光度法测定水中氨氮的影响[J].干旱环境监测,2015,29(1):37-41.
[11]王燕,朱春刚,许笛,等.一种大批量测定沉积物微量间隙水样品中溶解态磷和铁含量的方法[J].环境科学,2014,35(4):1271-1277.
[12]林莉莉,鐘旋,包思聪,等.影响水中总氮检测准确度的关键因素探析[J-环境工程,2017 (35):119-122.
[13]
Laskov C,Herzog C,Lewandowski J,et aL Miniatur-ized photometrical methods for the rapid analysis ofphosphate, ammonium. ferrous iron. and sulfate inpore water of freshwater sediments[J]. Limnology andOceanography-Methods, 2007,5(1):63-71.
[14] 贺金明,毛彩绵,影响纳氏试剂法测定水中氨氮实验条件的因素分析[J].中国卫生检验杂志,2016,26 (3):453-454.
[15]朱美华,葛沭锋,王庆刚,等.纳氏试剂分光光度法测定水中氨氮——显色时间对测试结果的影响[J].能源环境保护,2018,32(2):51-53.
[16]赵艳,毕荣宇,牟德华.利用酶标仪测定6种食用菌中多糖含量[J].食用菌,2013(1):59-61.
(编辑:李慧)
作者简介:王文静,女,工程师,主要从事水环境监测工作。E-mail: sofie2008@sina.com