瘤胃源酵母的分离筛选及其在不同精粗比饲粮中对瘤胃体外发酵的影响

高晓莎 ，段晋伟，张艳冰，韩郭皓，钞瑞敏，裴彩霞，武晋孝，古少鹏*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2.山西省饲料兽药监察所，山西太原 030027）

为提高反刍动物的生产效率，饲养过程中大量使用高精料日粮，导致反刍动物瘤胃pH 降低，微生物功能紊乱，以瘤胃酸中毒为主的代谢性疾病发病率增高，造成养殖业经济损失巨大[1]。在日粮中添加益生菌可使瘤胃pH 升高，恢复瘤胃微生物功能，可防止瘤胃酸中毒的发生和维持瘤胃微生物平衡[2]。在高精料条件下，活性酵母可以通过提高瘤胃内pH，降低瘤胃乳酸含量，提高微生物利用氨态氮（NH3-N）的效率和合成微生物菌体蛋白（MCP）的能力，提高瘤胃挥发性脂肪酸（VFA）含量来改善瘤胃内环境，从而提高对营养物质的消化和吸收[3]。目前养殖生产中所用的酵母产品菌株主要来自外界环境，而这种消化道外的酵母菌的生存环境与瘤胃环境并不一致，这可能影响酵母菌在动物消化道内的作用效果，导致当前所用的酵母产品在反刍动物生产中的应用效果不稳定，因此，利用源自于动物消化道内的微生物可能避免酵母菌在反刍动物生产中应用效果不稳定的问题[4]。

本试验旨在分离筛选瘤胃源性酵母，通过体外发酵技术，研究在不同精粗比饲粮中添加酵母菌对反刍动物瘤胃发酵参数的影响，为研制防治亚急性瘤胃酸中毒（SARA）的微生态制剂提供菌株。

1 材料与方法

1.1 模拟瘤胃体外发酵装置 采用100 mL（具有5 mL分刻度）的具塞玻璃注射器（LABORTECHNK D-89173 Lonsee-Efflenschieβ，德国）作为人工瘤胃体外产气管。

1.2 瘤胃液的采集及酵母菌的分离纯化 于晨饲前分别从4 头装有永久性瘘管的荷斯坦雄牛和4 只装有永久性瘘管的杜泊羊×小尾寒羊杂交羊（牛、羊饲喂日粮组成及营养成分见表1、表2）的瘤胃抽取瘤胃液，4 层纱布过滤，置于充有CO2的保温瓶。取1 mL 过滤后的瘤胃液，以10、100、1 000 倍的梯度稀释，将稀释后的瘤胃液涂布于制备好的麦芽汁琼脂培养基[5]，置于39℃的恒温培养24～48 h，培养过程中观察菌落生长情况，挑取形态、颜色等不同单菌落进行卢哥氏染色镜检，并通过平板划线的方法对其进行反复纯化，至所有菌株形态完全一致后保存备用。

1.3 酵母菌的筛选

1.3.1 乳酸利用率的测定 将分离纯化的酵母菌置于含一定浓度的乳酸液体培养基[4]，39℃，180 r/min 恒温振荡器培养24 h，使用分光光度计，在波长为560 nm 下，通过对羟基联苯比色法测定培养基中乳酸含量，计算酵母菌对乳酸的利用率。

1.3.2 生长曲线的测定 将乳酸利用率较高的菌株置于麦芽汁肉汤培养基，39℃，180 r/min 培养，从0 h 开始至24 h 结束，每2 h 取样1 次，4℃保存。同时做空白对照，使用分光光度计在波长为600 nm 下测定OD值，绘制生长曲线。

1.4 酵母菌的鉴定 将筛选出的乳酸利用率较高、生长速率较快的菌株于麦芽汁肉汤培养基培养24 h 后，收集菌液。将收集到的菌液送至上海凌恩生物科技有限公司通过18S rRNA 测序。引物序列：上游引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'），下游引物NS4（5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'）。PCR 扩增反应体系为50 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 10 mmol/L 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，Taq 酶0.5 μL，去 离 子 水35.5 μL。反 应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 个循环，72℃修复延伸10 min，4℃保存。测序结果通过BLAST 数据库进行比对，再使用MEGA（7.0）软件构建系统进化树。

表1 牛日粮组成及营养成分（干物质基础）

表2 羊日粮组成及营养成分（风干基础） %

1.5 酵母菌对不同精粗比饲粮瘤胃体外发酵参数的影响

1.5.1 人工唾液的配制 参照 Menke 等[6]注射器式培养方法进行瘤胃体外发酵培养。人工唾液参照布同良[7]所述方法进行配制。

1.5.2 试验设计与瘤胃液接种 将筛选的酵母菌用麦芽汁肉汤培养基进行增菌培养，采用血球板计数法计数，使菌液的含菌量为3×108CFU/mL。

试验日粮以玉米为主要精料原料，以玉米秸秆、苜蓿干草、青贮饲料为主要粗料原料，配制日粮精粗比分别为5:5（日粮A）、6:4（日粮B）和7:3（日粮C）的日粮，3 种日粮组成成分及营养成分见表3。每种日粮设置3、6、9、12、20、28、36、48 h 8 个采样时间点，每个采样时间点设置3 个重复。测定各个时间点的产气量、pH、NH3-N 浓度、VFA 浓度、MCP 浓度及干物质降解率。

表3 日粮组成及营养成分（风干基础） %

于晨饲前采集杂交肉羊瘤胃液，经4 层纱布过滤后，装入充有CO2的保温瓶，迅速将瘤胃液与缓冲液（人工唾液）按1:2 的比例制备培养液，按培养液70 mL 加入7 mL 酵母菌液的比例制备发酵液，取30 mL 发酵液加入已装有不同精粗比日粮的发酵管（整个过程中需要通入CO2以保持发酵管的厌氧环境），迅速放入39℃的恒温水浴摇床培养。

1.5.3 样品的采集与处理 待各时间点培养结束后，采集样品，立即记录各发酵管中的总产气量，测定各发酵管培养液pH，将培养液置于-20℃冰箱保存，随后取样测定NH3-N、VFA、MCP 浓度；同时将发酵残留物用蒸馏水冲洗后放入65℃烘箱烘干，测其降解率。

1.6 测定指标及方法 培养液中pH 用酸度计测定；产气量根据注射器活塞顶起的刻度直接读数[8]；NH3-N 浓度采用冯宗慈等[9]比色法紫外分光光度计测定；VFA浓度采用毛细管气相色谱（安捷伦GC-6890N，美国）测定[10]；MCP 浓度采用考马斯亮蓝法测定；干物质降解率根据发酵后残留物烘干后的重量计算，计算公式：干物质降解率=（底物干物质重量－发酵后残渣干物质重量）／底物干物质重量×100% 。

1.7 统计分析 数据采用Excel 进行初步整理，SPSS 22.0 软件进行单因素ANOVE 分析，并用Duncan´s 法和LSD 法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。采用Sigmaplot （10.0）对时间与各指标进行一元线性和一元二次曲线回归分析。

2 结果与分析

2.1 瘤胃源酵母的分离纯化 瘤胃液经平板涂布、划线分离，在麦芽汁琼脂培养基上大量挑取菌落呈乳白色或红色，大小1～2 mm，棋子状突起，边缘整齐，表面湿润的单菌落，反复纯化培养；在麦芽汁液体培养基中培养，管壁有菌环，管底有沉淀，液体澄清。显微镜下观察，呈椭圆状，多为单个或成对出现。最终从奶牛瘤胃中分离得到32 株疑似酵母菌菌株，从杂交肉羊瘤胃中分离得到15 株疑似酵母菌，共47 株。

2.2 瘤胃源酵母的筛选 获得12 株乳酸利用率较高的疑似菌株，其中8 株生长速率较快（图1、图2）。选取1 株乳酸利用率较高且生长速率较快的疑似酵母菌菌株，编号为N09 号。

2.3 瘤胃源酵母菌的鉴定 将测序所得的序列采用BLAST 软件，与GenBank 中的序列进行同源性比较，结果发现，N09 号分离株与Candida rugosa种相似性达到99.78%（图3），故将该菌归属于Candida rugosa种，即褶皱假丝酵母菌，命名N09 号酵母菌。

2.4 N09 号酵母菌对不同精粗比饲粮瘤胃体外发酵参数的影响

2.4.1 N09 号酵母菌对瘤胃体外发酵产气量的影响 由图4 可知，3 组日粮精粗比的发酵时间与产气量均存在线性关系，随着时间的延长，各组产气量增加；产气量随着日粮精粗比的提高有降低趋势；在各时间点，3 组培养液的产气量基本为6:4 组高于5:5 组和7:3 组。

2.4.2 N09 号酵母菌对瘤胃体外发酵干物质降解率的影响 由图5 可知，3 组日粮精粗比的干物质降解率与时间存在线性关系，各组随着培养时间的延长，干物质降解率增加；同一时间，随饲粮精粗比的增加，干物质降解率呈增加趋势；除9、36 h 时，5:5 组与6:4 组无显著性差异外，其余各时间点6:4 组和7:3 组的干物质降解率均显著高于5:5 组，且在各时间点，3 组干物质降解率为7:3 组高于6:4 组和5:5 组。

2.4.3 N09 号酵母菌对瘤胃体外发酵pH 的影响 由图6可知，3 组日粮精粗比的时间与pH 之间均存在线性关系，随着培养时间的延长，pH 逐渐降低；pH 随日粮精粗比的升高有降低的趋势。除在20、48 h 时，其余各时间点，6:4、7:3 组培养液pH 显著高于5:5 组。

2.4.4 N09 号酵母菌对瘤胃体外发酵NH3-N 浓度的影响由图7 可知，3 组日粮精粗比的时间与NH3-N 浓度之间均存在线性关系，各组随培养时间的延长，NH3-N 浓度升高；随饲粮精粗比的升高，3 组培养液NH3-N 浓度呈降低的趋势（P＞0.05）。

2.4.5 N09 号酵母菌对瘤胃体外发酵MCP 浓度的影响由图8 可知，3 组日粮精粗比的时间与MCP 浓度之间均存在一元二次曲线关系，各组培养液中MCP 浓度随时间的延长先升高后降低；随饲粮精粗比升高，MCP浓度呈升高趋势，除12 h 外，其他时间点，3 组培养液MCP 浓度差异不显著。

2.4.6 N09 号酵母菌对瘤胃体外发酵VFA 浓度的影响3 组日粮精粗比的时间与VFA 浓度之间均存在线性关系，3～36 h，各组培养液中总VFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度随时间延长呈上升趋势，乙酸/丙酸呈下降趋势。总VFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度在9、20 h 时5:5 组和7:3组显著高于6:4 组，12、36 h 时，5:5 组和7:3 组高于6:4组；在28 h 时，总VFA、乙酸浓度5:5 组显著高于6:4组和7:3 组，丙酸和丁酸浓度差异均不显著；48 h 时，总VFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度5:5 组和6:4 组显著高于7:3 组；乙酸/ 丙酸除在20 h 时6:4 组显著高于5:5组和7:3 组，其余各时间点差异均不显著（图9）。

3 讨 论

研究表明，活性干酵母或酵母培养物能够改善瘤胃微生物菌群结构，抑制乳酸产生菌并刺激乳酸利用菌的生长，降低高精料日粮条件下瘤胃乳酸含量，提高瘤胃pH 和瘤胃总VFA、乙酸、丙酸浓度，降低NH3-N 浓度，稳定瘤胃内环境[3-11]。本研究从瘤胃中筛选出1 株乳酸利用率较高，生长速率较快的菌株，该菌对乳酸的利用率可达62.69%，说明其对乳酸具有较强的代谢能力；体外发酵试验表明，在高精料日粮条件下，添加该菌提高了瘤胃内pH 和总VFA、乙酸、丙酸浓度，降低了NH3-N 浓度，说明酵母菌可以提高反刍动物瘤胃内pH，预防SARA 的发生。

体外发酵产气量是评定反刍动物瘤胃发酵的重要指标，在一定程度上可以反映干物质降解率的程度[12]。有研究表明，添加益生菌可以通过消耗瘤胃内氧气使发酵液环境处于厌氧状态，分泌有机酸等营养物质，在一定程度上促进纤维素的分解[13]。本试验中，添加酵母菌后发酵液的产气量和干物质的降解率与娜仁花等[8]试验相比均有提高，且随着培养时间的延长，产气量和干物质的降解率呈增加趋势，说明添加酵母菌刺激了瘤胃微生物的生长，这与丁洪涛等[14]的研究结果一致。

pH 是反映瘤胃发酵状况的一个综合指标，而饲粮精粗比是影响瘤胃pH 的一个重要因素，通常认为正常瘤胃的pH 变化范围为6.0～7.0[15]。研究显示[16]，精粗比在7:3 时，可导致SARA 的发生。本试验结果显示，随饲粮精料比例的增加，瘤胃pH 有升高的趋势，pH变化范围在6.10～6.61，高于周为琴等[17]在日粮精粗比为6:4 时的pH，说明添加酵母菌对瘤胃pH 有调节作用，可以刺激瘤胃内乳酸利用菌的生长，提升瘤胃pH，防止在高精日粮条件下瘤胃pH 降低。目前，大多数学者认为pH＜5.6 时，反刍动物发生SARA。本试验各组的pH 均在正常范围，说明添加酵母菌在高精日粮下可维持瘤胃pH 正常，预防SARA 的发生。

瘤胃NH3-N 是饲料蛋白在瘤胃中的降解产物，是菌体蛋白合成的原料；因此，NH3-N 浓度在一定程度上能反映蛋白质降解与合成间的一个平衡状态。本试验中，在不同精粗比饲粮条件下，随发酵时间的延长，NH3-N浓度升高，随精料比例的增加，添加酵母菌，各组发酵液间NH3-N 浓度和MCP 浓度变化不大，但与陈晓霞等[18]的试验在精粗比5:5 时结果相比，瘤胃NH3-N 浓度降低，说明添加酵母菌可以使瘤胃内NH3-N 更多的转化为菌体蛋白，从而使瘤胃内NH3-N 浓度降低，MCP 浓度升高。

VFA 是瘤胃微生物降解日粮中的碳水化合物的终产物，是维持反刍动物机体能量的重要来源[19]，乙酸/丙酸值是反映能量利用率的重要指标。本试验中，随发酵时间的延长，总VFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度呈上升趋势，乙酸/ 丙酸呈下降趋势，随饲粮精粗比的增加，VFA 无明显的规律性。娜仁花等[8]在精粗比为6:4 时的瘤胃体外发酵试验中，在2～18 h 时乙酸含量为24.9～33.1 mmol/L，丙酸含量为6.47～9.13 mmol/L。而本试验添加酵母菌液后，VFA 含量均高于娜仁花等[8]试验中VFA 含量，表明添加酵母菌能够增加瘤胃中活菌数量，加速饲粮中碳水化合物的降解，提高粗饲料的利用率，具有促进VFA 产生的作用，这与张翔飞[3]的试验结果一致。

4 结 论

瘤胃体外发酵试验显示，在饲粮中添加N09 号酵母，可以降低瘤胃液pH，促进体外发酵产气量的增加，提高干物质的降解率，可为生产中预防高精日粮条件下SARA 的发生提供参考依据。