枸芪提取物对育肥猪胴体性状、肉品质及脂质代谢的影响

郝 壮，高 倩，李德琰，金 娜，邹闻书，李建东，陈长增，刘凤华

（北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

植物提取物中的多种生物活性成分具有抗氧化、调节免疫、降血糖、抗菌等多种生理作用[1]，且植物提取物毒性小，副作用少，安全性高，引起广泛关注与研究。有研究发现，植物提取物可显著提高畜禽的平均日增重，降低耗料增重比，改善生产性能和肉品质[2]，还可改善肠道健康、降低腹泻率和死亡率、增强免疫力、提高抗病能力[3]；还能缓解和预防运输应激，减少对动物的影响。

肌内脂肪（IMF）对嫩度、风味、多汁性的影响较大[4]，与消费者感官接受度呈正相关[5]，是人们评判肉品质的一项重要指标。近年来，许多学者进行了脂代谢相关研究，鉴定出与脂代谢相关的多个基因。例如，PLIN5可调节细胞内脂质代谢和脂肪酸氧化，维持细胞内脂质稳态[6]；脂肪组织中去饱和酶（SCD）[7]与脂肪酸含量有关[8]。随着生物技术的发展，高通量测序已成为研究脂代谢的有效便捷的方法。

前期研究表明，枸芪提取物具有提高育肥猪生长性能的作用[9]。本试验旨在研究在饲料中添加枸芪提取物改善育肥猪肉品质的效果，利用RNA 测序技术鉴定影响脂质代谢的相关基因和通路，为养殖生产及相关研究提供技术支持和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本试验所用的枸芪多糖提取物为实验室自制，枸杞、黄芪（1:2）共1 500 g，加10 倍量的水煎煮、干燥，加淀粉至900 g，粉碎，混匀经过提取、浓缩至密度1.20～1.30 g/mL（50℃）、减压干燥后制得，每克枸芪提取物中复合多糖含量为114.7 mg[10]。

1.2 试验设计及饲养管理 以胎次、日龄、体重和血缘相近的原则，选取80 日龄健康的大白×长白二元杂交猪180 头，随机分成2 组，每组6 个重复，每个重复15 头，对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮+200 mg/kg枸芪提取物，基础日粮组成与营养成分见表1。试验于2015 年7 月25 日—10 月28 日在北京市顺义区北京汇川兆亮牧业有限公司进行，试验期90 d。试验期间，试验猪自由采食、自由饮水。试验开始和结束当天，结束饲喂并称量空腹体重。

表1 基础饲粮组成及营养成分

1.3 胴体性状测定 试验结束时，在对照组、试验组各选3 头屠宰。参照《猪性能测定规程》（DB43/T356-2007）进行测定并计算屠宰率、平均背膘厚、眼肌面积。

屠宰率=胴体重（kg）/宰前体重（kg）×100%

平均背膘厚（cm）=（皮下脂肪肩部最厚处+胸椎与腰椎结合处+腰椎与荐椎结合处）/3

眼肌面积（cm2）=（最后肋骨处背最长肌横断面）高度×宽度×0.7

1.4 肉品质指标测定 试验猪被宰杀45 min 内，取胸腰椎连接部背最长肌新鲜横切面，采用美制NPPC 肉色比色板（1991 版）和NPPC 大理石纹比色板（1991版），同步进行目测肉样评分；试验猪被宰杀后立即取背最长肌置于液氮罐中，用于高通量测序；使用东北农业大学工程学院研制的C-LM3 型数显式肌肉嫩度仪，垂直于肌纤维方向测定肌肉嫩度；屠宰后2 h 内，切取倒数第3～4 胸椎段背最长肌，采用悬吊法测定滴水损失；使用真空干燥箱进行水分测定；使用酸度计测定仪pH210 在肉样上进行刺孔测定，猪被宰杀后45 min 内，测定值记为pH45min，经0～4℃成熟24 h 后，测定值记为pH24h；灰分依据《肉与肉制品 胆固醇含量测定》（GB/T 9695.24-2008）方法测定。

1.5 肌肉营养成分测定 屠宰后取背最长肌（不少于2 kg）冷冻送往农业农村部农产品质量安全监督检验测试中心（北京）检测粗蛋白质、粗脂肪等营养成分。采用凯氏定氮法测定冷冻肉样的粗蛋白质含量。将冻干后的肉样按索氏抽提法测定干样的脂肪含量，即将肉样进行无水乙醚浸泡过夜，65℃抽提6～8 h，回收烘至恒重称重。维生素A 参照《肉与肉制品 维生素A 含量测定》（GB/T 9695.26-2008）方法测定；维生素E 参照《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E 的测定》（GB 5009.82-2008）方法测定；胆固醇参照《肉与肉制品 胆固醇含量测定》（GB/T 9695.24-2008）方法测定。参照《肉与肉制品 脂肪酸测定》（GB/T 9695.2-2008）测定13种脂肪酸含量。

1.6 RNA 测序 提取样品总RNA 后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA 向得到的mRNA 中加入Fragmentation Buffer 使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成cDNA 第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA 第二链，经过QiaQuick PCR 试剂盒纯化并加EB 缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR 扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq2500 进行测序，测序读长为PE100。然后使用hisat2[11]比对猪参考基因组，通过基因组比对率来评估样本的情况。

基因表达量使用FPKM 值法计算：

FPKM=cDNA Fragments/[Mapped Fragments（Millions）×Transcript Lentth（kb）]

式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片 段 数 目，即 双 端Reads 数 目；Mapped Fragments（Millions）表示比对到转录本上的片段总数，以106个碱基为单位；Transcript Length （kb）：转录本长度，以103 个碱基为单位。

1.7 荧光定量PCR 检测 使用Trizol（Sigma，Germany）提取背最长肌肉组织总RNA，然后根据制造商说明使用Primescript RT Master Kit（TaKaRa，中国大连）反向转录成互补DNA（cDNA）。差异基因（DEGs）引物由引物3 设计（http://primer3.ut.ee/）。荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）在AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme，Nanjing，China）进行，反应体积20 μL：Super Real Pre Mix Plus:10 μL（1×），上、下游引物各0.6 μL（0.3 μmol/L），cDNA 1 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL（1×）；ddH2O 7.4 μL。循环参数：95℃ 5 min，其次是40 个扩增循环，每个95℃ 10 s，然后60℃ 30 s。所有反应均为每个样品进行3 次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参基因，使基因的相对表达正常化。基因表达水平采用2－ΔΔCT值法计算。

1.8 统计分析 试验数据采用SPSS 18.0 软件进行单因子t 检验，试验数据均以平均值±标准差表示。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 枸芪提取物对育肥猪胴体性状的影响 由表2 可知，与对照组相比，试验组猪的屠宰率升高5.68%（P＜0.05），背膘厚无显著差异，眼肌面积增大4.1%（P＜0.05），提示饲料添加枸芪提取物对猪的胴体性状产生了有利影响。

表2 枸芪提取物对育肥猪胴体性状的影响

2.2 枸芪提取物对育肥猪猪肉理化特性的影响 由表3可知，与对照组相比，试验组肌肉水分、pH 和粗蛋白质含量差异均不显著；肉色评分提高51.57%（P＜0.05），且在肉色正常范围内；大理石纹评分升高48.55%（P＜0.05），滴水损失下降37.55%（P＜0.05），剪切力降低20.60%（P＜0.05）。

由表4 可知，与对照组相比，试验组肌肉粗脂肪含量降低21.43%（P＜0.05），胆固醇含量降低34.96%（P＜0.05），维生素A、维生素E 和粗灰分含量分别增加29.41%、71.89%和13.17%（P＜0.05）。

2.3 枸芪提取物对育肥猪猪肉脂肪酸含量的影响 由表5 可知，与对照组相比，试验组肌肉亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等必需脂肪酸（EFA）总含量升高2.77 倍（P＜0.01），豆蔻酸、棕榈酸和十七碳酸等饱和脂肪酸（SFA）总含量下降17.74%，油酸和棕榈油酸等不饱和脂肪酸（UFA）含量升高19.18%（P＜0.05），而且UFA 与SFA 比值上升。

表3 枸芪提取物对育肥猪肉理化特性的影响

表4 枸芪提取物对育肥猪猪肉营养成分的影响

表5 枸芪提取物对育肥猪猪肉中脂肪酸含量的影响

2.4 基因表达分析和差异基因鉴定 6 个背最长肌样本间相关系数均不低于0.990，表明样品之间表达模式的相似度非常高，组间肌肉转录组的绝大部分没有发生变化（图1-A）。

将转录组测序结果按照P＜0.05、|log2FC|＞1 的标准进行筛选，共得到256 个差异基因，其中有114 个上调、有142 个下调（图1-B）。对差异基因进行功能注释，筛选到102 个脂代谢相关基因（DEGs），将各组差异基因分组聚类分析（图1-C），可以看到组内样品平行性良好，组间差异显著。为了检验转录组测序结果，随机挑选10 个差异基因（DGAT2、APOE、ADIPOQ、ALDH3A2、PRKG1、PLIN5、SCD、ELOVL6、MOGAT1、AQP4）通过qRT-PCR 技术测定其表达量，分别比较10 个基因在转录组、qRT-PCR 实验结果中的差异倍数，结果显示，qRT-PCR 测得的基因表达趋势与转录组一致（图2）。

2.5 差异基因GO 富集分析和KEGG 富集分析 GO 分析表明，筛选出的DEGs 与单不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代谢、脂蛋白分解、脂肪酶活性等生物学功能有关。Pathway 通路分析结果显示，它们主要参与甘油脂质代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪细胞中脂多糖的调节等。

3 讨 论

3.1 枸芪提取物对育肥猪胴体性状的影响 屠宰率、背膘厚及眼肌面积是反映屠宰性能的重要指标，是衡量猪肉用性能的重要指标，与养猪生产的经济效益息息相关。Zhang 等[12]研究发现，黄芪、白芍、茯苓、合欢、使君子、枳实、柴胡等中草药提取物可使猪胴体的眼肌面积显著增加11.92%，平均背膘厚显著下降29.34%；吕慧源等[13]在育肥猪日粮中添加黄芪、金银花为主的中草药添加剂，可明显改善育肥猪的胴体性状。本研究结果表明，在日粮中添加200 mg/kg 枸芪提取物组猪的屠宰率和眼肌面积较对照组分别提高5.68%和4.1%。由此可见，枸芪提取物可改善育肥猪的胴体性状。

3.2 枸芪提取物对育肥猪肉理化性质的影响 猪肉品质的理化指标包括肉色、大理石纹、系水力、pH 和剪切力等；影响猪肉香味与嫩度的的主要因素是肌内脂肪含量，且香味与嫩度、风味物质含量等指标高度相关；滴水损失和剪切力直接影响肉的口感和品质[14]。本研究结果表明，与对照组相比，试验组肉色评分提高51.57%，大理石纹评分显著提高48.55%，滴水损失降低37.55%，剪切力降低20.60%，水分与pH 无显著变化，表明枸芪提取物可以提高肌间脂肪的沉积；有研究表明，胆固醇与心血管疾病息息相关[15]。人体中1/4 的胆固醇来自摄入的动物源食品，猪肉作为重要的肉食产品，低胆固醇猪肉逐渐成为热门话题。维生素A 对细胞膜有着稳定作用，维生素E 具有抗氧化功能，能保护细胞免受自由基的攻击。李大光等[16]研究表明，在育肥猪日粮中添加枸杞子、五味子和松针粉等植物提取物，可以提高育肥猪的屠宰率与瘦肉率；试验组背最长肌SFA比对照组显著降低27.15%，而试验组UFA 比对照组显著提高了15.42%，从胆固醇的测定结果来看，试验组比对照组显著降低了9.1%。本研究结果显示，添加枸芪提取物后胆固醇含量显著降低34.96%，灰分、维生素A 和维生素E 含量都显著增加，脂肪含量则显著下降。

多不饱和脂肪酸（PUFA）作为人体必需的营养物质，有促进细胞生长、调控基因表达、调节视力和脑发育等作用；PUFA 代谢生成的脂质调控介质对炎症的启动、发展以及消退均具有重要调节作用；PUFA 还是影响猪肉风味的主要因素，其含量提高影响猪肉的风味与品质。本研究中，试验组猪肉的亚油酸、亚麻酸含量分别是对照组的2.79、3.39 倍，显著高于普通猪肉；EFA、SFA、UFA 和UFA/ SFA 的相对含量均有不同程度提高；黄红卫等[17]研究表明，随着育肥猪日粮中枸杞渣添加量的增加，猪肉中亚油酸和花生酸、γ-亚麻酸等EFA 呈急剧提高的趋势，对提高猪肉膳食保健功能具有潜在效果。本研究表明枸芪提取物对脂肪酸的组成和含量具有一定的调控作用。综上所述，枸杞与黄芪不管是和其他中草药配伍还是单独作为饲料添加剂，对育肥猪生长性能、胴体性状和肉品质等方面均有不同程度的调控作用。

3.3 转录组水平上讨论枸芪提取物对猪肉脂质代谢的影响 本研究发现，在256 个差异显著的基因中有102 个差异基因与脂代谢相关，占总数差异基因的40%；GO富集分析结果显示，脂肪酸代谢过程和脂肪酸转运都与脂代谢相关；Pathway 分析发现，不饱和脂肪酸生物合成和甘油脂质代谢等均参与脂肪酸的合成，用qRTPCR 技术对转录组的数据进行验证，结果与转录组相符。

SCD 是催化合成单不饱和脂肪酸的限速酶[18]，是影响猪的IMF 中脂肪酸构成的重要因素，与IMF 呈正相关[19]，这与本研究结果相符。脂肪细胞C1Q 和胶原蛋白结构（ADIPOQ）编码生成脂联素，间接影响肌肉脂肪酸氧化和葡萄糖摄取[20]，与脂肪沉积高度相关[19,21]，ADIPOQ 还与胆固醇和低密度脂蛋白的浓度有关。载脂蛋白E（APOE）在胆固醇等脂类转运和代谢过程中发挥重要作用[22]，其通过多个途径影响人的胆固醇代谢、脂质稳态、葡萄糖代谢等功能，敲除APOE基因后血液中胆固醇含量升高[23]。但本试验发现，APOE 与猪背最长肌的脂代谢密切相关，胆固醇含量显著下降可能与APOE 有关。二酰基甘油酰基转移酶2（DGAT2）是甘油三酯（TG）合成的限速酶，与畜禽脂肪沉积、背膘厚有关[24]，在脂质代谢中扮演着重要的角色。本研究数据显示，DGAT2 上调、粗脂肪含量下降，这可能是由于游离脂肪酸增多导致。此外，本研究首次发现PPKG1基因可能与脂质代谢相关。

综上所述，枸芪提取物在转录组水平上干预某些脂质代谢的关键基因，从而提高猪肉不饱和脂肪酸含量，提高猪肉品质；从分子水平上提供一种更好理解枸芪植物提取物改善猪肉品质的信息，为下一步研究指引了方向。

4 结 论

本试验结果表明，枸芪提取物可改善育肥猪胴体性状、猪肉理化性质；在转录组水平上干预某些脂质代谢的关键基因，提高猪肉中不饱和脂肪酸和人体必需脂肪酸含量，显著改善猪肉品质。