双水相–SPE–TFA–GC/MS 测定烟草中 糖苷类潜香物质方法的建立

彭振兴，郭东锋，王正刚，姚忠达，张福建，牛慧伟

(1.安徽中烟工业有限责任公司，安徽 合肥 230088；2.中国烟草总公司职工进修学院，河南 郑州 450000)

烟草中的糖苷是一类由单糖或低聚糖的羟基氨基硫羟基和另一分子中的半缩醛羟基等失水而产生的化合物[1]，是烟叶生长过程中形成的次级代谢产物[2]。糖苷相对分子质量较大，沸点较高，香气较少或本身没有香气，但在卷烟燃吸过程中经高温加热或燃烧裂解能释放出香气香味[3-4]。GREEN等[5]发现，烟草中的非挥发性香气前体以糖苷形式存在，水解释放出3-羟基二氢大马酮和3-酮基紫罗兰醇等香气物质。用气相色谱法、高效液相色谱法对烤烟中的香气成分及糖苷成分进行分析，但一次只能分离鉴定出很少几种成分[6-12]。烟草中糖苷类物质含量较低，且与水溶性糖、游离态香味物质、生物碱和色素等的性质相近[13-17]，较难获得纯净的标准样品。刘百战等[18]用甲醇提取烟样中糖苷成分，采用非离子型大孔树脂(AB-8) ，选用乙醚－正己烷萃取，使烟草中的糖苷与可溶性糖、氨基酸、有机酸、游离香味成分分离。田振峰等[19]用甲醇连续超声萃取，再用正己烷-乙醚萃取后得到含有糖苷类物质的溶液，用二氯甲烷萃取，经酸洗、碱洗，得到有机层，干燥后即为糖苷精提物。胡雅琴等[20]用甲醇重复提取烟样，过DM-401 层析柱，且用二氯甲烷萃取，采用蒸馏萃取(SDE)法分离烟草样品中的香味成分。笔者尝试建立双水相提取-固相萃取(SPE)-三氟乙酰衍生化(TFA)-GC/MS 的方法，测定烟草中糖苷类潜香物质，并对糖苷类香气成分进行分析，为进一步明确烟草中糖苷类潜香物质成分、提高烟草香味品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器

甲醇、正戊烷、二氯甲烷、吡啶溶剂购自Sigma-Aldrich，均为色谱纯；硫酸铵、碳酸钾、磷酸氢二钾、氯化钠等购自国药集团，均为分析纯；衍生化试剂三氟乙酰胺(MBTFA)购自Pierce (Rockford, IL)；糖苷标准物质购自Sigma-Aldrich。

主要仪器：5973N型气相色谱质谱仪(Agilent)；HP-20 SPE固相萃取小柱(北京绿百草科技发展有限公司)；Milli-Q系统(Millipore, Bedford)；超声波发生仪(BRANSON)；微波反应器(Sairem)。

1.1.2 烟叶原料

2018年，采集云南玉溪烤烟K326的C3F、湖北恩施白肋烟Kenek中部叶、云南保山香料烟Basma中部叶样品，烘干后粉碎过孔径0.25 mm筛，低温密封储存。

1.2 烟叶糖苷测定方法的建立

1.2.1 微波辅助双水相提取

准确称取0.5 g烟叶粉末，加入10 mL甲醇中，超声溶解30 min，离心，取上清，加入由甲醇与K2HPO4(质量比为20∶11)组成的双水相体系，微波反应器中火作用2 min后，静置冷却，取上相，过0.45 µm膜，制得糖苷粗提物。

1.2.2 固相萃取

将5 mL糖苷粗提物加到HP-20 SPE小柱上，以0.5 mL/min流速缓慢通过小柱，依次用20 mL超纯水、15 mL正戊烷-二氯甲烷洗脱，洗脱速度1.0 mL/min，最后用20 mL甲醇洗脱，洗脱速度为2.0 mL/min，收集甲醇洗脱液，浓缩至干，得糖苷精提物。

1.2.3 衍生化试剂的选择及其反应条件的优化

选择MBTFA作为衍生化试剂，比较不同反应温度(40、50、60、70 ℃)、不同反应时间(30、40、50、60、70 min)、不同试剂用量(100、200、300、400 μL)对衍生化结果的影响。

1.2.4 GC/MS 分析

用5973N型气相色谱质谱仪，对衍生化的物质进行气相色谱-质谱联用分析测定。色谱柱为DB-5 MS柱(长30 m、孔径0.25 mm、膜厚0.25 μm)。程序升温：起始温度120 ℃，保持1 min，以3 /min℃ 升至220 ℃，再以5 /min℃ 升至280 ℃，保持10 min。进样量1.0 μL，分流比10∶1，进样口温度240 ℃。质谱条件：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，离子化方式EI，电子能量70 eV，全扫描，质量范围40～600 amu。苷元采用标准物质及NIST谱库比照定性，定量采用与内标2-硝基苯-β-D-葡萄糖苷的衍生化产物面积比来计算(假定响应系数相等)。

2 结果与分析

2.1 衍生化反应优化条件

MBTFA衍生化条件优化试验结果见图1。反应温度从40 ℃提高到60 ℃，衍生化产物的峰面积随着温度的升高而增加，温度继续升高到70 ℃时，峰面积反而有所减小。反应时间30～60 min时，衍生化产物的峰面积随着时间的延长而增加，继续延长反应时间，峰面积无变化。MBTFA的用量从100 µL增加到400 µL，结果最低用量即能达到良好的衍生化效果，增加衍生化试剂用量对于衍生化效率无明显影响，反而会增加GC/MS分析的基质背景，影响目标物的定性定量。

图1 不同温度、时间、试剂用量下衍生化产物的峰面积 Fig.1 Peak area of derivatives under different temperatures, reaction times, and MBTFA amounts

综上，选择衍生化反应条件为：100 µL MBTFA试剂，在温度60 ℃水浴条件下，衍生化反应60 min，即可完成衍生化。

图2为糖苷精提物经三氟乙酰衍生化后的GC/MS图谱。从图中可以看出，各目标物分离良好，通过与标准物质及标准谱图(NIST)对比，共定性鉴定出烟草中18种糖苷键合态香味成分，包括14种葡萄糖苷(β-D-吡喃葡萄糖苷)、1种芸香糖苷(α-L-吡喃鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)和3种巢菜糖苷(α-L-吡喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)。EI质谱分析结果见表1，可明确其苷元类型为脂肪醇、芳香族化合物、降异戊二烯类、倍半萜类和多酚类化合物。

图2 烟叶糖苷衍生化产物的气相色谱质谱图谱 Fig.2 Typical GC/MS separation of TFA glycosidic extracts from tobacco

TFA衍生化产物的EI质谱数据分为糖元和苷元2个部分进行解析，其中苷元部分离子丰度普遍比糖元部分强，并且这两部分的碎片离子之间没有交叉和干扰，这也使糖苷结构的定性更加简单。

表1 烟草中糖苷类潜香物的定性分析 Table 1 Glycosides qualitative identification for TFA derivatives from flue-cured tobacco

2.2 双水相–SPE–TFA–GC/MS 法测定烟叶糖苷类潜香物成分

运用建立的方法对烤烟、白肋烟、香料烟样品进行测试分析，GC/MS谱图结果见图3。可以看出，3种烟叶样品都检测到18种糖苷类潜香物成分，且分离良好；定量结果表明，各组分RSD均小于10%，重现性较好。

图3 烟叶样品糖苷衍生化产物的气相色谱质谱图谱 Fig.3 GC/MS separation of TFA glycosidic extracts from different types of tobaccos

烟叶糖苷的定量测定结果见表2。烤烟和白肋烟中糖苷类成分含量较香料烟的高，烤烟烟叶中含量较高的糖苷有4-羟基苯乙醇-3-O-葡萄糖苷、3β-羟基-螺岩兰草酮-3-O-葡萄糖苷和东莨菪苷等，白肋烟烟叶中含量较高的糖苷有3-甲基-丁醇-3-O-葡萄糖苷、苯甲醇-3-O-葡萄糖苷和苯乙醇-3-O-葡萄糖苷等。主成分分析结果表明，烤烟总糖苷含量与P4 号、P12 号、P15 号、P14 号4 种糖苷显著相关，白肋烟总糖苷含量与P6 号、P7 号、P9 号、P10 号、P17 号5 种糖苷显著相关，而香料烟总糖苷含量与18 种糖苷没有显著相关性，表明通过糖苷成分分析可以有效区分3 种不同类型的烟叶。

表2 不同类型烟草的糖苷的相对含量 Table 2 Relative concentrations of glycoside compounds in three types of tobaccos

3 结论

建立的双水相提取-固相萃取SPE-三氟乙酰衍生化TFA-GC/MS方法，能检测出烟草中18种糖苷类潜香物质，包括14种葡萄糖苷(β-D-吡喃葡萄糖苷)、1种芸香糖苷(α-L-吡喃鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)和3种巢菜糖苷(α-L-吡喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)，并明确了苷元类型包括脂肪醇、芳香族化合物、降异戊二烯类、倍半萜类以及多酚类化合物。

运用该方法对烤烟K326、白肋烟Kenek、香料烟Basma烟叶中18种糖苷类潜香物组分进行测定分析，结果表明，烤烟中多酚类以及倍半萜系类糖苷含量明显高于其他烟叶，白肋烟中含量较高的糖苷则为降异戊二烯类糖苷，而香料烟中芳香族苷元所占比例最大，烤烟中糖苷类潜香物含量最高，香料烟中含量最低。