适用于酱油酿造乳酸菌的筛选及应用

符姜燕　侯冶海　刘善策　滑欢欢　赵红娟　梁帆

摘 要：从低生物胺酱醪中筛选出1株嗜盐四联球菌，经2号滤纸过滤及镜检证实，该菌株是以几个细胞连接的状态进行生长繁殖，在整个生长过程中不产生生物胺，用于酱油酿造中可大大减少酱油二次沉淀的生成量，亦可提高酱油生物安全性。因此，在酱醪发酵阶段添加嗜盐四联球菌，是解决国产酱油二次沉淀和生物胺问题的有效手段。

关键词：酱油;乳酸菌;沉淀;生物胺

中图分类号 TS264.21文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）12-0101-04

Abstract： In this study， a strain of T. halophilus was screened from the low-biological amine sauce mash. Filtering and microscopic examination of No. 2 filter paper confirmed that the strain was growing and multiplying with several cells connected; the strain did not Bio-amines are produced and used in soy sauce brewing， which can greatly reduce the amount of secondary precipitation of soy sauce， and can also improve the safety of bio-amines in soy sauce.

Key words：Soy sauce; Lactic acid bacteria; Sediment; Biogenic amine

醬油在调味品行业中占有重要地位，在呈香、味、色方面已具有其他调味品不可替代的功能。酱油酿造是以源自大豆和小麦的植物蛋白质及碳水化合物为主要原料，生产涉及到多种有益微生物的联合协同作用。其中最重要的是乳酸菌和酵母菌，它们主要作用是发酵糖类产生醇、醛、酸、酯、酚类等风味物质。其中乳酸菌是酱油发酵醪中主要的微生物，在发酵过程中，耐盐性乳酸菌产生乳酸、乙酸等种类丰富的有机酸，从而使整个发酵体系的pH值开始下降，当发酵体系的pH值下降至适宜酵母菌生长繁殖的时候，耐盐酵母菌便开始大量生长繁殖，生产以醇类为主的各种小分子物质，赋予酱油特有的醇味，同时大量的醇类物质与有机酸发生酯化反应产生酯类等风味物质，赋予酱油特有的风味。

乳酸菌（Lactic acid bacteria， LAB）是一类能利用可发酵糖类产生大量乳酸的细菌统称，有球菌、杆菌之分。发酵酱油中添加乳酸菌，不仅能提高酱油的营养价值，还可改善酱油的风味。目前，国内外对乳酸菌用于酱油后发酵以促进酱油香气和风味形成的研究很多，崔瑞迎等将耐盐乳酸菌用于高盐稀态发酵，发现酱醪中2-甲基丁酸、2-甲基丁醇、乙酸异戊酯质量分数分别较对照组高53.4%、337.3%、388.2%。严留俊对乳酸菌增加酱油风味进行了探讨性研究，确定了多菌种混合顺序变温发酵法进行酱油发酵的可行性。刘卓研究了添加耐盐乳酸菌与酱醪中的酵母的协同作用，以及耐盐乳酸菌对发酵工艺的控制和对酱油主要风味的影响。结果表明，在酱醪发酵过程中，添加耐盐乳酸菌明显促进T酵母的生长，而与S酵母存在着相互促进的关系。结合广式高盐稀态发酵酱油的工艺特点与乳酸菌的形态结构及乳酸菌的代谢产物对乳酸菌进行更深层次的研究发现，乳酸菌种类中的嗜盐片球菌在酱醪中是以多个细胞集聚存在的，半成品原油过滤后（烛式过滤器），可去除大部分乳酸菌菌体，从而减少货架期酱油的二次沉淀。经研究表明，一些乳酸菌可进一步分解酱醪中的酪氨酸、组氨酸等氨基酸态氮生成生物胺等有害物质，影响酱油口感，危害人体健康。

笔者选取低生物胺酱醪进行耐盐乳酸菌的分离，并根据其细胞形态、代谢产物等筛选出适用于酱油酿造的乳酸菌菌株，以解决酱油行业普通存在的二次沉淀难题，降低酱油中有毒有害物质含量，提高酱油品质及风味。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料 酿造酱油生产原料：黄豆、面粉、麸皮，从市场采购。曲霉：广东美味鲜调味食品有限公司菌种库提供。酱醪：广东美味鲜调味食品有限公司中山厂区所得，生物胺含量≤ 200mg/mL的发酵45d左右的酱醪;生物胺标准品（腐胺、尸胺、组胺、酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亚精胺）、乙酸钠、乙氰、三乙胺、CuSO4、亚甲基蓝、酒石酸钾、亚铁氰化钾、葡萄糖、AgNO3、NaOH、四硼酸钠、Na2HPO4等均为分析纯，购自中国医药集团上海化学试剂公司;L-组氨酸盐酸盐、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸盐酸盐、溴甲酚紫、磷酸吡哆醛，均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 主要仪器和设备 高效液相色谱仪：美国Waters分析仪器有限公司;Kjeitec2300凯氏定氮仪：瑞典FOSS分析仪器有限公司;WFZ UV-2100紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司;H1850R台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司;5415D高速离心机：德国艾本德股份公司;FE20实验室pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 培养基配方 MRS培养基（g/L）：酪蛋白胨10、牛肉浸取物10、酵母提取物5、葡萄糖20、乙酸钠5、柠檬酸二胺2、吐温80 1、磷酸氢二钾2、七水硫酸镁0.2、七水硫酸锰0.05、氯化钠100，pH6.8，121℃高压蒸汽灭菌15min。

液体脱羧酶固体培养基（g/L）：胰蛋白胨酵母抽提物5.0、酵母粉5.0、牛肉膏5.0、葡萄糖0.5、氯化钠100、柠檬酸铵2.0、磷酸氢二钾2.0、MnSO4 0.2、FeSO4 0.04、碳酸钙0.3、磷酸吡哆醛1.0、溴甲酚紫0.06、赖氨酸5.0、鸟氨酸盐酸盐5.0、L-组氨酸盐酸盐2.0、色氨酸2.0、酪氨酸1.0、pH5.3，121℃高压蒸汽灭菌15min。

固体脱羧酶培养基（g/L）：琼脂粉20，其他成分同液体脱羧酶培养基，pH5.3，121℃高压蒸汽灭菌10min。

1.3 乳酸菌分离纯化

1.3.1 乳酸菌富集培养 取低生物胺酱醪10g，接种于100mL高鹽MRS液体培养基中，32.5℃培养5d。

1.3.2 不产生物胺乳酸菌初筛 将富集培养后的菌液用无菌生理盐水进行稀释，取不同梯度的稀释液100μL于固体脱羧酶培养基上进行涂布，于32.5℃培养箱中培养5d，挑取黄色或白色阴性菌落并编号，多次划线纯化后接种于液体MRS培养基，于32.5℃培养箱中培养5d后置于4℃冰箱保存。

1.3.3 高效液相色谱复筛 将初筛菌株接种于液体脱羧酶培养基中，32.5℃培养5d，对其发酵液进行HPLC检测。

（1）标准溶液的制备。准确称取生物胺各50mg，用丙酮配制成1mg/mL的储备液备用。分别取以上标准品储备液1mL，用丙酮配制成最终浓度分别为1.0、2.5、5.0、10、15、25、50mg/L的混合标准溶液，铝箔包住，4℃避光保存备用。

（2）标准溶液的前处理。取1mL各梯度的标准溶液于10mL离心管中，加入1mL丹黄酰氯溶液、1mL饱和NaHCO3溶液，涡旋混匀，60℃水浴30min，每隔10min开盖放气摇匀。待溶液温度降至室温后，加入100μL氨水，混匀，60℃水浴15min，取出冷却至室温。向其中加入3mL乙醚进行萃取，待涡旋混匀后静置1h，吸取上层有机层于新的离心管中，向下层溶液中重新加入3mL乙醚，重新萃取2次。对所收集的上层液进行60℃吹氮，待吹干后，向离心管中加入1mL乙腈，晃动使乙腈充分接触离心管壁，用0.22μL的有机膜过滤[10]。

（3）样品的前处理。把培养5d的液体脱羧酶培养液进行12000r/min离心10min，取1mL上清液加入10mL离心管中，再加入1mL丹黄酰氯溶液、1mL饱和NaHCO3溶液，进行衍生。衍生、萃取步骤同标准溶液。

（4）色谱分析。色谱条件：GEMINI C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，美国phenomenex公司），检测波长254nm，进样量20μL，柱温30℃，流速1mL/min。流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：0～1min，B=65%（体积分数）;1～10min，B=80%（体积分数）;10～15min，B=90%（体积分数）;15～25min，B=90%（体积分数）;25～30min，B=65%（体积分数），外标法定量。

1.3.4 依据菌体形态进行复筛 高盐MRS培养液，通过显微镜观察菌落形态，并通过2号滤纸过滤，对比过滤前后菌液的澄清度。

1.3.5 适于酱油酿造的菌株16S rDNA鉴定筛选 该步骤由广东省微生物研究中心完成，并给出检测报告，确定该菌株的种属。

1.3.6 乳酸菌的应用 将不产生物胺且通过2号滤纸过滤澄清的菌株应用于酱油酿造中，跟进发酵结束后酱油的生物胺含量及二次沉淀的含量。具体步骤为：（1）实验室规模制作大曲：蒸熟的黄豆与面粉按照1∶0.4比例混合，接种米曲霉3.042，装入铝饭盒中于30℃恒温培养44h，制得成熟的大曲。（2）实验室规模制醪：150g大曲与450g浓度为25%的盐水混合制成酱醪，装于1L三角瓶中。（3）将扩大培养好的菌株扩培液分别添加至酱醪中，使得每瓶酱醪中的细胞数达到106 CFU/mL，以不添加菌株的酱醪为对照样。（4）将混有菌株的酱醪放置在30℃培养箱，恒温发酵30d，每10d检测上清液的pH。发酵完成后，送检水黄中组胺和酪胺的含量，进而判断菌株产生物胺的能力，同时留样观察减少二次沉淀的效果。

2 结果与分析

2.1 固体脱羧酶培养基初筛 通过脱羧酶固体培养基平板显色试验进行不产生物胺乳酸菌的初步筛选，如图1所示，显色培养基上的菌落颜色有紫色、白色和黄色。根据平板显色原理，由于生物胺为碱性物质，因此产生物胺菌的菌落会使指示剂变为紫色，不产生物胺菌的菌落为黄色，通过平板初次筛选得到26株疑似不产生物胺的乳酸菌，编号分别为M1～M26。

2.2 HPLC检测复筛 为了确认初步筛选到的26个阴性菌株是否为不产生物胺的菌株，采用HPLC法检测26个菌株发酵液中的生物胺含量，结果如表1所示。

由表1可知，通过HPLC法检测，有3株菌（编号为M3、M6、M26）均不产生生物胺，有15株只产生组胺，有8株产生组胺和酪胺2种生物胺。

2.3 细胞形态复筛 分析酱油二次沉淀形成的主要原因为微生物菌体，结合酱油生产工艺可以得出，菌体细胞抱团生长（4个或者8个细胞连接在一起）的菌株在二次沉淀方面有一定的作用，因此采用2号滤纸过滤菌液，过滤后澄清的菌株适用于酱油酿造。编号为M3、M6、M26的菌株显微镜细胞形态及过滤前后的结果如图2所示。

如图2所示，菌株M6细胞是不集聚生长，滤液经过过滤后仍然浑浊;菌株M3细胞是不集聚生长，过滤后的滤液虽然较未过滤前澄清，但仍有少量浑浊不透明，M26菌株细胞是集聚生产，菌液经过过滤后，滤液澄清透明。通过上述2次筛选后，M26菌株不产生物胺且2号滤纸过滤后澄清透明，该菌株可以用于酱油酿造，因此将该菌株进行分子鉴定，确定其种属。

2.4 16S rDNA鉴定结果 经16S rDNA鉴定，菌株M26为嗜盐四联球菌。该菌株分解糖类物质，产生有机酸，提高酱油风味，且细胞形态为集聚生长，可大大减少酱油二次沉淀的生成量。

2.5 乳酸菌应用效果 由表2、3可知，在酱油发酵期间添加嗜盐四联球菌M26，发酵结束后添加M26菌种的酱油生物胺较未添加的减少80.3%，添加M26后酱油二次沉淀析出时间校未添加的晚15d，且放置60d时试验样酱油二次沉淀减少89.56%。说明在酱油发酵期间添加M26菌种，可以减少酱油中的二次沉淀，同时降低天然油中生物胺含量。

3 结论与讨论

试验结果表明，从低生物胺酱醪中分离得到1株嗜盐四联球菌M26，其细胞形态为集聚生长，可大大减少酱油二次沉淀的生成量，改善了酱油外观品质;该菌株不产生生物胺，将其添加到酱油发酵酱醪中可降低酱油生物胺的含量，提高了酱油生物安全性;该菌株分解糖类物质，产生有机酸，在一定程度上能改善酱油风味。下一步将对该嗜盐四联球菌改善酱油二次沉淀的机理及其在酱油大规模生产中的应用进行深入研究。

参考文献

[1]高献礼，闫爽，陈燕斌，等.基于统计学方法的酱油二次沉淀形成的初步研究[J].食品工业科技，2013，34（3）：188-192.

[2]邹阳，赵海锋，赵谋明.高效液相色谱法同时测定酱油中的8种生物胺[J].现代食品科技，2012，28（5）：570-573.

[3]刘玉晗，卢士玲，陆静，等.乳酸菌中生物胺氧化酶菌株的筛选[J].现代食品科技，2016，32（4）：106-113.

[4]吴世君，周建民.乳酸菌和酵母菌的添加时期及添加量对酱醪发酵的影响[J].中国调味品，1989（7）：27-31.

[5]张妙霞，雷晓凌，李学恭，等.鱼露中乳酸菌及其主要产品指标关系研究[J].现代食品科技，2009，25（12）：1408-1411.

[6]陈伯林.耐盐乳酸菌在酱油发酵中的应用[J].现代食品科技，2011，27（11）：1340-1343.

[7]刘文丽，程池，姚粟，等.韩国食品用微生物菌种管理现状[J].食品与发酵工业，2015，41（11）：237-242.

[8]Singracha P.， Niamsiri N.， Visessanguan W.， et al. Application of lactic acid bacteria and yeasts as starter cultures for reduced-salt soy sauce （moromi） fermentation [J].LWT-Food Science and Technology，2017，78：181-188.

[9]Lim E.S.， Lee N.G. Control of histamine-forming bacteria by probiotic lactic acid bacteria isolated from fish intestine [J]. Korean Journal of Microbiology，2016，52（3）：352-364.

[10]Gao X.L.， Zhao H.F.， Zhao M.M.， et al. A comparative study on physicochemical properties of Chinese-type soy sauces prepared using pure koji and mixed kojis [J]. African Journal of Biotechnology，2010，9（40）：6740-6747.

[11]Shalaby A.R. Significance of biogenic amines to food and human health [J]. Food Research International，1996，29：675-690.

[12]Herpandi L.S.D.， Simamora G.R.R. Effects of different Pediococcus halophilus level and fermentation time on chemical properties of fermented anchovy paste “terasi ikan” [J].Materials Science and Engineering，2017，193：012004.

（責编：徐世红）