尾巨桉组织培养研究

林桦，邓海燕，曾奇，莫晓勇

尾巨桉组织培养研究

林桦1，邓海燕2，曾奇2，莫晓勇2＊

(1.中林集团雷州林业局有限公司，广东 湛江 524043；2.华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642)

选用已经通过无性系测定的优良无性系单株尾巨桉M8，以其半木质化嫩枝为外植体，采用正交试验设计方法，探讨不同浓度和不同种类激素的组合处理对尾巨桉M8增殖和生根效果的影响。结果表明：(1)对尾巨桉M8增殖效果的影响激素大小排序为：6-BA>IBA>KT；综合有效芽数、增殖系数、苗生长情况以及试剂成本选优，确定配方G2( 6-BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1)对尾巨桉M8的增殖效果最优，其中平均苗高为2.50 cm，增殖系数达4.49；(2)根据生根率和根的粗壮程度筛选出的对尾巨桉M8生根效果最佳的激素组合配方为YG5 配方(IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1)，生根率达87.5%，每株平均生根数3.67根，根长约0.6 ~ 1.8 cm，根一般粗壮，苗长势好，移栽成活率达91%。因此，适用于尾巨桉M8的较优增殖培养基为：改良MS + 6-BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+卡拉胶6.8 g·L-1)，pH为5.8，可实现苗木生长健壮，有效芽数多，高增殖系数。最优生根诱导培养基为1/2MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 蔗糖15 g·L-1+ 卡拉胶8 g·L-1，pH为5.8，可实现组培苗移栽时移栽成活率高。

桉树；组织培养；增殖；培养基；6-BA；IBA

桉树()组培苗具有保持母体优良性状、繁殖系数大、生长期短等优点，在种源缺少的条件下可快速满足市场需求。因此，组织培养是桉树优良品种快速繁殖的必要途径，对加速桉树人工林营建、提高其产量和质量有重要意义[1]。桉树组织培养始于20世纪60年代，随着技术的发展，越来越多桉树种类的快繁体系被建立[2]。不同种类的桉树在外植体消毒、愈伤组织诱导与丛芽发生、增殖培养和生根培养等方面对培养基和激素的需求存在一定差异。本研究以优良无性系单株尾巨桉(×)M8的半木质化嫩枝为外植体，在初代培养的基础上，采用正交试验设计方法，探讨16种不同浓度和不同种类激素的组合处理对尾巨桉M8增殖效果的影响，并研究9种不同浓度和不同种类激素的组合处理对其生根效果的影响，以期提高M8组培繁殖效率，为M8组培苗的工厂化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

以通过无性系测定的优良无性系单株尾巨桉M8的大树基部经环割后萌发的枝条(生长时间1 ~ 2个月)作为外植体，采集萌条时间为春季3－4月。外植体消毒和初代培养后获得的芽苗数量较少，难以充分发挥组培快繁的优势，需通过继代增殖培养获取大量增殖材料，用于生根。

1.2 不同激素及其浓度配比对增殖效果的影响

筛选出适合M8增殖的培养基、6-BA、IBA和蔗糖浓度以及适宜pH范围后，进一步研究不同分裂素和生长素浓度配比对M8增殖效果的影响。按照L16(43)进行三因素、四水平的正交试验(表1)。将萌发长约1 cm的腋芽切下，接种到不同激素以及不同激素浓度配比的增殖培养基上，筛选出最适宜的增殖配方。每个处理接种5瓶，每瓶8棵芽，均重复3次。每处理的基本培养基均为改良MS，其他添加物为蔗糖 30 g·L-1+卡拉胶6.8 g·L-1，pH为5.8。并置于光照强度1 500 ~ 2 000 lux、光照时间12 h·d-1、温度为25℃的条件下进行培养。接种20 d后统计相关数据及苗生长状况。

表1 不同激素种类、浓度及其配比对增殖影响的正交试验设计 mg·L-1

1.3 生根培养

待增殖芽苗长至2 cm以上时，切取1.5 ~ 2 cm的带顶芽茎段作为生根芽，接入不同的生根培养基中。每处理5瓶，每瓶8棵芽，重复3次。每处理以1/2MS为基本培养基，其他添加物为蔗糖15g·L-1+卡拉胶 8 g·L-1，pH值为5.8。置于光照强度1 500 ~ 2 000 lux、光照时间12 h·d-1、温度为25℃的条件下进行培养。25 d后观察生根情况，统计根生长数据等，并记录苗生长状况。试验处理见表2.

1.4 炼苗移栽

待根长至约1 cm，移至温室炼苗。一周后将生根苗取出，于清水中轻轻洗净粘附在根上的培养基，并将苗移栽至经高锰酸钾消毒的基质中，移栽后喷水覆膜以保湿保温，两周后进行常规水肥管护。

1.5 数据统计与分析

试验中所有数据采用WPS 2013和SPSS 19.0软件进行统计分析。评价指标如下：

增殖系数=总芽数/接种芽数

有效芽数：芽长≥1.2 cm 的芽数

生根率/%= (生根苗数/接种总数)×100%

移栽成活率/%=(成活苗数/移栽总苗数)×100%

表2 不同浓度配比的 IBA 和 NAA 的生根试验 mg·L-1

2 结果与分析

2.1 不同激素及其浓度配比对增殖效果的影响

植物生长时通常需要多种激素共同发挥作用，想要同时获得高生长和增殖，不仅需要调节某单一激素的含量，更需要调节激素间的含量配比，以得到最佳激素种类和浓度的配比。

由表3可知，不同激素浓度配比处理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽数以及增殖系数的值分别为18.808、30.678和56.054，均为<0.01，表明不同处理间的苗高、有效芽数以及增殖系数均存在极显著差异。

对苗高和每瓶有效芽数影响显著的激素有IBA和6-BA，对增殖系数均有显著影响的激素是KT和6-BA(表4)。

表3 不同处理对增殖效果的单因素方差分析

注：“**”表示<0.01，“*”表示<0.05，下同。

表4 不同激素种类及其配比对增殖效果的多因素方差分析

由表5可知，在6-BA浓度为1.0 mg·L-1的G4、G6、G9、G15处理中，其苗高、有效芽数和增殖系数均最低，与其他处理相比其叶色浅、叶间距小、叶片不够舒展、苗长势一般，可见高浓度的6-BA不适宜M8的增殖；当6-BA浓度一定时，在IBA浓度为0.05 ~ 0.5 mg·L-1的范围内，苗高随着IBA浓度的增加呈先升高后降低的趋势，说明IBA对苗高有一定影响；当6-BA浓度一定时，KT浓度变化对有效芽数及增殖系数的影响变化不明显，在添加了KT的处理中，G8和G13表现最好，苗高均约2 cm，有效芽数约30棵·瓶-1；当KT浓度一定时，6-BA在0.1 ~ 1.0 mg·L-1范围内，其增殖系数和有效芽数是呈先增大后减小的趋势，当6-BA浓度超过0.5 mg·L-1时会产生愈伤组织；低浓度的6-BA有利于M8的增殖，当6-BA浓度在0.1 ~ 0.2 mg·L-1，其增殖系数均超过3；在未添加KT的G1、G2、G3、G4处理中，表现最好为G2，该处理的苗高、有效芽数和增殖系数分别为2.5 cm、30.53棵·瓶-1和4.49，是所有处理中最高的，并与其他处理存在显著差异；添加了KT的处理G13其有效芽数和增殖系数分别为29.20棵·瓶-1和4.01，表现良好，但苗高为1.96 cm，较G2的稍低。

表5 不同激素种类及其配比对增殖效果的影响

由表6可知，不同激素对有效芽数和增殖系数影响也不同。6-BA对M8的有效芽数最明显，极差值为11.62，其次为IBA(2.38)和KT(1.29)；6-BA对增殖系数的影响最显著，极差值为1.37，其次为KT(0.29)和IBA(0.16)；生长素IBA对M8增殖影响很小，因为生长素一般是促进苗高生长，同时协同细胞分裂素促进继代苗增殖。

对苗高影响显著的激素中，6-BA>IBA；对每瓶有效芽数影响显著的激素中，6-BA>IBA；对增殖系数有显著影响的激素中，6-BA>KT，由此可见不同激素对尾巨桉M8增殖效果的影响依次为：6-BA>IBA>KT。综合有效芽数、增殖系数、苗生长情况及试剂成本，确定配方G2(6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1)对尾巨桉M8的增殖效果最优。

2.2 生根培养

一般而言，芽苗在不添加任何激素的培养基上也可生根，但为使植株能够快速生根获得成苗，需在培养基内添加一定比例的激素进行生根诱导。将长势良好的顶芽截取约1 cm、接种至生根培养基中，10 d左右开始长根，15 ~ 20 d为出根高峰期，20 d 后大部分根长齐。不同激素浓度配比对生根的影响试验结果见表7 ~ 10。

表6 增殖正交试验极差分析与Duncan多重比较

注：同列数据后大写字母表示<0.01，小写字母表示<0.05，下同。

表7 不同处理对生根效果的单因素方差分析

由表7可知，不同激素浓度配比处理的生根率和生根条数的值分别为12.812、8.52(<0.01)，表明不同处理间的生根率和生根条数均存在极显著差异。由表8可知，生根率和生根条数在不同的IBA浓度、NAA浓度下差异均显著。

表8 不同激素种类及其配比对生根效果的多因素方差分析

表9 不同激素种类及其配比对生根效果的影响

表10 生根试验极差分析与Duncan多重比较

从表9可知，当NAA浓度一定时，在IBA浓度范围为0.2 ~ 1.0 mg·L-1内，生根率随着IBA浓度升高而呈先升高后降低的趋势，生根率增加，根的条数先增加后减少，根的粗壮程度增加，出根整齐，其中表现最好的为YG5，生根率高达87.5%，根粗细适宜，出根整齐，长势好。IBA浓度为0.2 mg·L-1时，YG1、YG2、YG3的生根率为50% ~ 70%，根的粗细程度偏细，出根不整齐，根长度较短。IBA浓度为1.0 mg·L-1，NAA浓度为0.05 mg·L-1的YG7处理的生根率达80%，但该处理长出的均为须根且很细，不适宜移栽；NAA浓度为0.1 mg·L-1(YG8)，其生根率亦接近80%，根的粗细一般，长度稍短一些，苗的长势不好且有落叶现象；NAA浓度为0.2 mg·L-1时(YG9)，其生根率最低(40%)，出根不整齐、叶片脱落、长势差。

极差分析结果可知(表10)，NAA对苗的生根率影响大于IBA，极差值分别为54.17和43.33，NAA在浓度为0.05 ~ 0.1 mg·L-1时其生根率大于浓度为0.2 mg·L-1时的生根率。通过比较均值和生长状况可知，生根效果最佳的激素组合配方为IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1(YG5)。

2.3 炼苗移栽

将试验所得的生根苗移至温室中炼苗1周后，移植到混合基质(泥炭：珍珠岩：蛭石=3:1:1)中，移栽后第3天用0.1%的甲基托布津溶液喷施叶面，移栽后前半月保温保湿，20 d后统计成活率，达91%。

3 结论与讨论

3.1 增殖培养

苗的增殖是组织培养中的重要环节，只有在增殖培养阶段获得较高的增殖系数和有效芽数，才可为后续生根出苗等奠定基础，才可体现出组培作为快速繁殖手段的优势。一般而言，影响组培材料增殖系数的因子主要是培养基、附加成分及其共同作用。培养基不同激素浓度以及不同的组合对组培材料的作用效果不同。在植物组织培养过程中，细胞分裂素6-BA具有诱导愈伤组织形成、促进芽的形成和促进组织分化等功能。激动素KT可诱导离体组织的细胞分裂和调节分化。生长素IBA在植物组培中一般用于促进苗高生长和诱导根的萌发，其对M8增殖与生长均有一定影响，适宜的浓度可促进苗的增殖与生长，浓度过高或过低则会对增殖产生一定的抑制作用。本研究的结果表明：对尾巨桉M8增殖效果产生影响的激素作用大小为：6-BA>IBA>KT，适用于尾巨桉M8的较优增殖培养基为：改良MS+ 6-BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 6.8 g·L-1卡拉胶)，pH为5.8。

3.2 生根培养

生根率及根的粗壮程度是评价组培苗生根效果的重要指标。尾巨桉M8最优生根诱导培养基为1/2MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 蔗糖 15 g·L-1+ 卡拉胶 8 g·L-1，生根率达87.5%，根一般粗壮，苗长势好，适合移栽。生根培养时间不宜超过一个月，否则移栽时会因苗龄过大，不易适应外界环境而降低移栽成活率。

3.3 移栽

本试验移栽选用基质为混合基质(泥炭：珍珠岩：蛭石=3:1:1)，移栽时间为春季，瓶苗移栽至基质的半个月内要进行喷雾和覆膜，保温且保持相对湿度在90%左右，注意预防病害，移栽成活率为91%。

[1] 江海涛.桉树组培快繁研究及其应用进展[J].现代物业(上旬刊),2012,11(7):64-67.

[2] 谢耀坚.桉树组织培养研究进展[J].世界林业研究,2000(6):14-19.

Study on Tissue Culture ofa ×

LIN Hua1, DENG Haiyan2, ZENG Qi2, MO Xiaoyong2

(1.524043,,; 2.,510642,,)

In order to examine effects of different hormones at different concentrations on proliferation and rooting of shoots of×clone M8 in tissue culture, semi-lignified shootswere used as explants and effects were studied in an orthogonal design trial. The results showed that the order of the hormones affecting M8 shoot proliferation was: BA > IBA > KT. The formula G2 (BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1) created optimal proliferation effects as judged by effective number of buds, multiplication factor, seedling growth and reagent costs. With this G2 formula the average shoot height was 2.50 cm and the multiplication factor was 4.49. Meanwhile, formula YG5 (IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1) was selected as the optimal hormone formula for M8 when judged by rooting rate and root strength. With this latter formula the rooting rate reached 87.5%, the average number of roots per plant was 3.67, root length was in the range 0.6 ~ 1.8 cm while roots were generally strong, seedlings grew well and transplant survival rate was 91%. From this study the optimal culture medium for M8 shoot production proved to be modified MS + BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ sucrose 30 g·L-1+ carrageenan 6.8 g·L-1with a pH of 5.8; this formula provided robust seedlings with a large number of effective shoots and a high proliferation coefficient. The optimal rooting medium was ½MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ sucrose 15 g·L-1+ carrageenan 8 g·L-1with a pH of 5.8, and this provided for high survival of tissue cultured seedlings.

; tissue culture; proliferation; culture medium; 6-BA; IBA

S722.3+7

A

10.13987/j.cnki.askj.2020.02.06

广东省林业科技创新项目“基于林相改造的桉树人工林质量精准提升技术”(2018KJCX028)

林桦(1973－ )，女，工程师，主要从事森林培育及职工技能培训，E-mail: 529475315@qq.com

莫晓勇(1962－ )，男，博士，教授，主要从事森林培育和森林经理研究，E-mail: motree@163.com