RP-HPLC法测定桦褐孔菌中紫萁酮含量

张勇，牛俊博，李福森，王晶，刘春明

（长春师范大学中心实验室，吉林长春130032）

桦褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）为大型珍贵药用真菌，属于多孔菌科褐卧孔菌，又名白桦茸，主要生长在俄罗斯远东、北美北部、芬兰、日本北海道以及我国黑龙江和吉林等地区[1]。药效作用研究表明，桦褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗氧化、抗衰老、降血糖、增强免疫力、防治艾滋病、调节血脂等多种药理活性[2-3]。据文献报道，桦褐孔菌中含有多种化学成分，如三萜、酮类、多糖、木质素、生物碱和黑色素类等成分[4-6]。其中，紫萁酮是桦褐孔菌中的主要活性成分，属于酮类化合物，可以调节血压、降低胆固醇，对病毒的增殖有明显的抑制作用[7]，此外，还具有杀死癌细胞和抗氧化的活性[8-10]，其药理作用广泛，且在桦褐孔菌中含量较高。目前文献报道中，主要对桦褐孔菌中某一类成分进行含量分析，如采用紫外分光光度计测定桦褐孔菌粗提物中总多糖、总三萜类化合物等进行含量[11-12]，应用氨基酸分析仪测定其各种氨基酸含量[13]。然而，对桦褐孔菌中紫萁酮这一单体化合物的定量分析还未见报道。中药质量控制需要对其中的有效成分进行较为准确的定性和定量分析。因此，需要建立能够准确、迅速检测桦褐孔菌粗提物中紫萁酮含量测定方法。

本研究以桦褐孔菌中紫萁酮为研究对象，建立反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC） 技术检测紫萁酮（C10H10O3）[14]（如图1）含量的分析方法，并对建立的HPLC分析条件进行了方法学考察。同时，采用所建立的方法对不同桦褐孔菌提取物中的紫其酮进行含量测定。

图1 紫萁酮（osmundancetone）的结构式Fig.1 The structural formula of osmundancetone

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（配DAD检测器）、柱温箱采用安捷伦配套装置（1100）、RP-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美国 Agilent公司；Hei-VAP 型旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；电子分析天平：德国桑塔瑞斯公司；FW-100型高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；YoungLin Istrument超纯水制备器：韩国YoungLin Istrument公司；KH-250DB型数控超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司。

桦褐孔菌：吉林省晏达顺参业有限公司；甲醇、醋酸（试剂均为色谱纯）：加拿大CaledonLaboratoriesLLtd.公司；紫萁酮（Osmundancetone）：成都普思生物科技有限公司；异丙醇、甲醇、乙醇分析试剂：北京化工厂。

2 试验方法

2.1 样品制备

2.1.1 不同溶剂提取

分别精密称取4份桦褐孔菌粉末5.000 1、5.000 4、5.000 5、5.000 8 g，分别加入100 mL的异丙醇、甲醇、95%乙醇、70%乙醇溶液，超声辅助提取1h。提取液进行抽滤，滤液减压回收至干，4 mL色谱甲醇溶解，过0.45 μm滤膜，4℃冰箱保存，待用。

2.1.2 不同方法提取

以甲醇为提取溶剂，分别称取桦褐孔菌粉末（5.000 8、5.000 7、5.000 2 g），分别采用超声辅助提取1 h、温度50℃，回流提取1h、温度80℃，微波辅助提取1 h、功率为180 W。提取物进行抽滤，滤液减压回收至干4 mL色谱甲醇溶解，过0.45 μm滤膜，4℃冰箱保存，待用。

2.2 标准品溶液的制备

精密称取紫萁酮对照品0.500 2 mg，加入1 mL的色谱甲醇制成浓度为500 μg/mL的贮备液，过0.45 μm的滤膜，紫萁酮对照品溶液，4℃冰箱保存，待用。

2.3 液相色谱条件

色谱柱 RP-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent，USA）；流动相：A 为甲醇，B 为 0.5%醋酸水，梯度洗脱条件：0～2 min（20%A→20%A），2 min～20 min（20%A→45%A），20 min～40 min（45%A→100%A），40 min～50 min（100%A→20%A）；柱温：25 ℃；检测波长：320 nm；流速：0.5 mL/min；进样量：5 μL。

3 结果分析与讨论

3.1 标准曲线的线性关系与范围

用色谱甲醇进行对紫萁酮标准品溶液进行稀释，浓度分别为 0.5、1、2.5、4、5 μg/mL，采用 HPLC 检测，以紫萁酮的浓度（M，μg/mL）为横坐标，峰面积（S）为纵坐标制作标准曲线（如图2），得到紫萁酮的回归方程，S=3 861.3M+42.977，相关系数r=0.999 9，结果表明，紫萁酮在 0.5 μg/mL～5 μg/mL 范围线性关系良好。

3.2 不同溶剂提取的比较

分别采用异丙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇作为溶剂，表明甲醇提取桦褐孔菌中紫萁酮有效成分效果较好，基线不平，提取效果虽然没有显著差异，但是异丙醇、95%乙醇、70%乙醇溶剂提取有较多杂质。用甲醇作为提取溶剂时，峰面积和峰形大小合适，确定用甲醇作为提取溶剂。用RP-HPLC检测不同溶剂提取物，如表1所示，结果表明桦褐孔菌的甲醇提取物中紫萁酮含量最高，达到0.107%。

图2 紫萁酮的标准曲线Fig.2 Standard curve of osmundancetone

表1 不同溶剂对紫萁酮含量的影响Table 1 The effect of different solvents on the content of osmundancetone

3.3 不同提取方法的比较

以甲醇为溶剂，分别采取超声辅助、回流、微波辅助对桦褐孔菌进行提取，用RP-HPLC分析不同方法提取物中紫萁酮含量，如表2所示。结果表明，不同提取方法对紫萁酮含量的影响不大，但超声辅助提取操作简单、方便、快速，提取效率高，超声辅助提取物中紫萁酮的含量为0.108%。

表2 不同提取方法对紫萁酮含量的影响Table 2 The effect of different extraction methods on the content of osmundancetone

3.4 方法学考察

3.4.1 桦褐孔菌液相图

采用2.3中HPLC条件下，超声辅助提取的桦褐孔菌甲醇提取物及紫萁酮标准品均得到较好的分离，结果如图3所示。

3.4.2 精密度试验

取2.2对照品溶液，按照2.3的色谱条件重复进样5次，测定色谱峰面积，以峰面积和保留时间考察精密度，紫萁酮峰面积的RSD为0.24%，紫萁酮保留时间的RSD为0.22%，表明仪器精密度良好。

图3 桦褐孔菌甲醇提取物及紫萁酮的RP-HPLC图Fig.3 RP-HPLC chromatograms of Inonotus obliquus methanol extract and osmundancetone

3.4.3 稳定性试验

选取同一样品溶液，分别于制备后的0、2、6、10、12、16、24 h，按上述色谱条件进行HPLC测定，不同样品中紫萁酮的相对峰面积的RSD为0.77%，表明样品在24 h以内稳定。

3.4.4 重复性试验

取同一批桦褐孔菌药材5份，以甲醇为溶剂，超声辅助提取物法制备样品溶液，分别应用HPLC进行测定。结果表明，桦褐孔菌中紫萁酮的平均含量为0.105 mg/g，峰面积含量的RSD为0.59%，表明该方法的重复性较好。

3.4.5 回收率试验

取同一批桦褐孔菌药材6份，按上述方法制备样品溶液，加入紫萁酮适量，按照2.3高效液相色谱的条件测定加样回收率，计算紫萁酮的加样回收率，结果如表3所示。

表3 平均回收率的测定结果Table 3 Determination of the average recovery

4 结论

本研究利用RP-HPLC法对桦褐孔菌中的紫萁酮成分的含量同时进行测定，分别以异丙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇作为溶剂，采用超声、回流、微波方法提取了桦褐孔菌中的紫萁酮有效成分，并用高效液相色谱（HPLC）进行定量分析，检测了该化合物的含量，结果表明，以甲醇为提取溶剂，超声辅助提取紫萁酮的效果较好，试验结果表明该方法和前期处理过程简便，含量测定结果准确，精密度、稳定性、灵敏度高和重复性良好。目前，桦褐孔菌广泛用于到保健品和化妆品中，该方法的建立为桦褐孔菌中紫萁酮的有效成分含量的测定和质量控制提供了一定的依据。