人参低聚肽对老年db/db小鼠血糖及免疫调节的作用

2020-07-21 08:25郝云涛刘欣然
食品工业科技 2020年14期
关键词:人参氧化应激脂肪

樊 蕊,郝云涛,刘欣然,李 勇

(北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,北京 100191)

糖尿病(Diabetes)是以高血糖为特征,由体内胰岛素分泌绝对或相对不足而引起以糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱为主的内分泌疾病。长期糖脂代谢紊乱可引起多系统损害,导致眼、肾、心脏、血管等组织器官的慢性进行性病变、功能减退及衰竭。如今,人口老龄化是全球正在面临的挑战,增龄可能是糖尿病发病的一个危险因素,同时糖尿病老年患者更是面临多种并发症,因此,预防老年人的糖尿病发生以及改善糖尿病老年患者的生存质量具有重要的意义。

早在1988年,有学者从人参中分离出一个具有胰岛素作用的14肽,表明其具有抗脂肪分解,降低血糖和肝糖原的作用[1]。随后,多项动物实验研究表明人参肽具有调节血糖血脂的作用,但这些研究涉及的动物模型均为人工造模[2-4],而对于自发糖尿病动物的降糖作用,特别是自发糖尿病老年小鼠的血糖水平和疾病状态鲜有报道。并且相比于多肽,低聚肽具有吸收快、安全性高、生物活性强的优点[5]。因此,是否可将人参低聚肽用于糖尿病的营养防治具有重要的现实意义。

研究报道,细胞衰老与糖尿病的关系复杂而微妙,糖尿病造成的高糖、炎症微环境及脂毒性等促使细胞衰老并进一步累积,反之,细胞衰老由于永久性周期停滞直接引起胰岛β细胞功能障碍、脂质代谢障碍等细胞功能障碍、通过间接分泌衰老相关分泌表型介导慢性低水平炎症状态等,引起糖尿病及其并发症[6]。可见,探讨老年糖尿病的疾病状态对提高老年糖尿病患者的生存质量具有重要的作用。

虽然以往研究报道人参肽可以降低过氧化损伤模型大鼠血清脂质氧化产物和蛋白质氧化产物含量,提高其血清抗氧化酶活力[7],并且可以减轻大鼠慢性炎症[8],但人参低聚肽是否可以通过调节糖尿病老年小鼠的炎症反应和氧化应激状态,达到改善血糖的效果并未有所证实。因此,本文对db/db小鼠进行终生喂养,对老年db/db小鼠进行血糖和糖耐量水平的测定,评价其炎症反应程度和氧化应激状态,评估人参低聚肽对老年db/db小鼠疾病状态的改善作用,为改善老年糖尿病患者的生存质量提供有效的膳食营养解决方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人参低聚肽 吉林肽谷生物工程有限责任公司,淡黄色固体粉末,利用生物酶解技术从吉林人参中得到的小分子生物活性肽的混合物。经过高效液相色谱纯化后,利用质谱仪分析,混合物中小分子低聚肽的质量分数占95.42%。进一步利用高效液相色谱法分析,可知其游离氨基酸总量占3.94%,氨基酸组成见表1;IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒 北京麦格泰克科技有限公司;GSH-Px、SOD、MDA试剂盒 北京中生北控公司;db/db 型小鼠 北京大学医学部实验动物中心提供(实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0010),屏障环境动物房(实验动物使用许可证号:SYXK(京)2016-0041)。

表1 人参低聚肽氨基酸成分表Table 1 The amino acid composition of Ginseng oligopeptide

安稳血糖仪、安稳血糖试纸 三诺公司;352型酶标仪 芬兰Labsystems Multiskan MS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组 选取10周龄的45只空腹血糖水平≥11.1 mmol/L的db/db雄性小鼠(体重23±2 g),按空腹血糖水平随机分为3组:老年模型对照组、阳性对照组(盐酸二甲双胍肠溶片225 mg/kg·bw)、人参低聚肽干预组(0. 50 g/kg·bw),每组15只。另取10周龄15只db/m雄性小鼠作为正常对照组,待以上小鼠饲养至57周,另取10周龄空腹血糖水平≥11.1 mmol/L db/db雄性小鼠(15只)作为青年模型对照组,各组小鼠继续饲养,终生干预。整个干预期各组小鼠均给予普通饲料,自由饮食、饮水。同时阳性对照组和人参低聚肽干预组分别予以相应剂量的二甲双胍和人参低聚肽,每天灌胃1次。饲养实验室符合国标清洁级,温度范围(25±1) ℃,相对湿度50%~60%,室内照明控制在12 h/12 h光暗周期节律。待老年模型组、正常对照组、阳性对照组和人参低聚肽干预组小鼠饲养至70周以后,青年对照组小鼠饲养至23周后,进行空腹血糖、糖耐量指标检测。老年模型组、正常对照组、阳性对照组和人参低聚肽干预组小鼠饲养至82周,青年对照组小鼠饲养至35周,处死。

1.2.2 指标检测

1.2.2.1 动物一般状态观察及体格指标测定 每周观测并记录动物的活动度、毛发光泽、摄食量、饮水量、体质重量。

1.2.2.2 随机空腹血糖检测 小鼠饲养至70周后,每隔4周监测随机空腹血糖,测定前禁食6 h,测定时剪尾取血,采用血糖仪测定及记录。

1.2.2.3 糖耐量检测方法 分别将饲养至82周的db/db和db/m小鼠,饲养至35周龄的青年db/db小鼠在测定前一天禁食12 h(自由饮水),禁食结束时灌胃给予葡萄糖溶液(50%质量分数),剂量为4 μg/g·bw,测定给予葡萄糖后0、0.5、1.0、2 h 的血糖值,并计算血糖曲线下面积。

血糖曲线下面积(AUC)=1/2×(0 h 血糖值+0.5 h 血糖值)×0.5+1/2×(0.5 h 血糖值+1 h 血糖值)×0.5+1/2×(1 h 血糖值+2 h 血糖值)×1

1.2.2.4 脏器质量和指数 分别将饲养至82周的db/db和db/m小鼠,饲养至35周龄的db/db小鼠,称重后脱颈椎处死,无菌快速分离肾周脂肪、睾周脂肪,剥离腓肠肌,称重;分别称取小鼠的肝脏、肾脏、脾、胰腺、肺,计算脏器指数/脂肪指数。

脏器/脂肪指数(%)=脏器/脂肪重量(g)/体重(kg)×100

1.2.2.5 血清炎症指标检测 分别将饲养至82周的db/db和db/m小鼠,饲养至35周龄的db/db小鼠,摘眼球采血,取血清,按照试剂盒说明书操作,检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

1.2.2.6 血清氧化应激指标检测 分别将饲养至82周的db/db和db/m小鼠,饲养至35周龄的db/db小鼠,摘眼球采血,取血清,按照试剂盒说明书操作,检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 一般状态观察

正常对照组小鼠状态良好,活动正常,反应灵敏,动作敏捷,毛色有光泽;老年模型对照组、青年模型对照组、以及阳性对照组和人参低聚肽干预组均出现明显的多饮、多食及多尿症状,并且活动量出现不同程度的减少,动作迟缓,被毛不光洁甚至脱毛的现象,但其中人参低聚肽干预组可以明显的观察到小鼠的反应和动作速度有一定程度的改善,并且脱毛现象也不及其它各组严重。

各组老年小鼠饲养至82周,正常对照组未见死亡,老年模型对照组死亡4只;阳性对照组死亡2只,人参低聚肽干预组死亡1只。

2.2 人参低聚肽对老年db/db小鼠血糖调节的影响

由表2可以看到,随着周龄增加,老年模型对照组小鼠血糖出现降低趋势,阳性对照组小鼠血糖出现增加趋势。老年模型对照组血糖高于正常对照组、阳性对照组和人参低聚肽干预组。其中老年模型对照组小鼠在70周龄时的空腹血糖显著高于正常对照组(P<0.05),同时,阳性对照组和人参低聚肽干预组的小鼠空腹血糖低于老年模型对照组(P<0.05)。随着饲养时间延长,阳性对照组和人参低聚肽干预组的小鼠空腹血糖显著低于老年模型对照组,但未呈现显著性差异(P>0.05),其原因可能是随着周龄的增加,老年模型对照组的血糖出现了下降的趋势,同时,老年模型对照组出现了一定数量的小鼠死亡现象,此想象与前期报道相似[9-10]。

表2 人参低聚肽对老年db/db血糖水平调节的影响Table 2 Effect of ginseng oligopeptide on blood glucose level in the aging db/db mice

由图1a可知,除了老年模型对照组在餐后1 h出现血糖峰值,且血糖峰值保持恒定,其他各组小鼠均在餐后0.5 h达到血糖峰值,随后血糖水平出现不同程度的下降,其中老年模型对照组的血糖峰值最高,其次为青年模型对照组,人参低聚肽干预组和正常对照组的血糖峰值较低。

图1b反映了各个组小鼠口服糖耐量的AUC变化,可以清楚看到,各个组小鼠AUC大小排序为:正常对照组<人参低聚肽干预组<阳性对照组<老年模型对照组<青年模型对照组,其中老年模型对照组、阳性对照组和青年模型对照组AUC显著大于正常对照组(P<0.05)。人参低聚肽干预组AUC与正常对照组AUC相当,说明人参低聚肽可以改善老年db/db小鼠的糖耐量水平。

图1 人参低聚肽对db/db小鼠糖耐量情况的影响Fig.1 The effect of ginseng oligopeptide on glucose tolerance in db/db mice注:与正常对照组相比,*代表差异显著,P<0.05。

2.3 人参低聚肽对db/db小鼠脏器质量和指数的影响

由表3可以看到,老年模型对照组小鼠的肝脏、肾脏、脾质量和指数均低于人参低聚肽干预组和阳性对照组,其中老年模型对照组脾质量显著低于正常对照组(P<0.05),而老年模型对照组和青年模型对照组的脾脏指数均显著低于正常对照组(P<0.05)。老年模型对照组的胰腺质量和指数均高于人参低聚肽干预组和阳性对照组,其中胰腺指数显著高于青年模型对照组(P<0.05)。老年模型对照和青年模型对照组的肾周脂肪质量显著高于人参低聚肽干预组和阳性对照组(P<0.05),而老年模型对照组的睾周脂肪质量和指数显著高于正常对照组、人参低聚肽干预组和阳性对照组(P<0.05)。

表3 人参低聚肽对db/db小鼠脏器质量和指数的影响Table 3 Effects of ginseng oligopeptide on organ mass and index in db/db mice

2.4 人参低聚肽对db/db小鼠炎症反应程度的影响

由表4可以看出,老年模型对照组IL-1β、IL-6含量均大于其余各组,而人参低聚肽干预组的IL-6低于正常对照组,同时显著低于老年模型对照组(P<0.05),TNF-α含量较高的组是青年模型对照组和老年模型对照组,而正常对照组和人参低聚肽干预组的TNF-α含量相当,均小于老年模型对照组、青年模型对照组。 此表明人参低聚肽干预可以降低炎症反应。

表4 人参低聚肽对db/db小鼠炎症反应程度的影响Table 4 Effects of ginseng oligopeptide on the inflammatory reaction in db/db mice

2.5 人参低聚肽对db/db小鼠氧化应激状态的影响

由表5可以看到,老年模型对照和青年模型对照组的MDA含量高于其他各组,但各组之间并未存在统计学差异,而老年模型对照组的SOD含量和GSH-Px含量显著低于正常对照组和人参低聚肽干预组、阳性对照和青年模型对照组(P<0.05)。

表5 人参低聚肽对db/db小鼠氧化应激状态的影响Table 5 Effects of ginseng oligopeptide on the oxidative stress status in db/db mice

3 总结与讨论

相比于正常对照组小鼠,db/db小鼠均出现明显的多饮、多食及多尿症状,并且出现不同程度的活动减少,动作迟缓,被毛不光洁甚至脱毛的现象。通过测定各个组小鼠的空腹血糖,可以发现,老年模型对照组血糖高于正常对照组、人参低聚肽干预组和阳性对照组,其中70周龄老年模型对照组小鼠空腹血糖显著高于正常对照组(P<0.05),同时,阳性对照组和人参低聚肽干预组的db/db小鼠空腹血糖显著低于老年模型对照组(P<0.05)。老年模型对照组和青年模型对照组的AUC高于阳性对照组和人参低聚肽干预组,并且老年模型对照组糖耐量表现出起点较低,血糖峰值出现较晚,血糖起伏大,但其血糖峰值持续时间长的特点。通过测定本实验使用的干预物人参低聚肽,其精氨酸含量丰富。研究显示,精氨酸能有效改善胰岛素抵抗,加速胰岛素分泌[11]。因此,推测人参低聚肽降低血糖的机制可能与人参低聚肽中富含精氨酸相关。

老年模型对照和青年模型对照组的小鼠的肝脏、肾脏、脾质量和指数均低于正常对照组和人参低聚肽干预组,其中老年模型对照组脾质量显著低于正常对照组(P<0.05),这与文献报道的db/db小鼠的脾脏小于db/m小鼠一致[12],这也符合肥胖糖尿病鼠免疫力低下的原则,这表明人参低聚肽干预可以在一定程度上提高老年db/db小鼠的免疫力。这与前期文献报道相似[13]。研究表明7月龄db/db纯合仔小鼠见胰腺、胰岛部分体积较大,胰岛中均见淋巴细胞浸润;12月龄db/db小鼠胰腺部分胰岛内及其周围组织有灶性淋巴细胞浸润,部分胰岛内见较多小导管样病变,胰腺小导管病变有增生扩张及潴留,使得胰岛细胞之间间隙增宽[12]。Homo-Delarche等[14]报道糖尿病动物模型会出现胰岛增生肥大的病理改变。本实验中同样发现老年模型对照组的胰腺质量和指数均高于人参低聚肽干预组。

老年模型和青年模型对照组的肾周脂肪质量显著高于人参低聚肽干预组(P<0.05),而老年模型对照组的睾周脂肪质量和指数显著高于正常对照组、人参低聚肽干预组和阳性对照组(P<0.05)。与皮下脂肪相比,内脏脂肪周围存在密集的血管,具有较高代谢活性,很可能与促炎症因子相关[15],更易产生大量TNF-α、IL-6等[16]。与脂肪指数显示的实验结果类似,老年模型对照组IL-1β、IL-6含量均大于其余各组小鼠的含量,研究表明肥胖患者伴随脂肪物质的过度沉积,容易引起炎症标记物的改变。过度的炎症反应,会引起相关的代谢平衡紊乱,如淋巴淤滞、氧化应激、内质网应激等,产生恶性循环并造成器官的代谢功能障碍。另一方面,脂肪细胞的过度肥大可促使细胞破裂,加剧炎症反应[17]。脂肪细胞对内质网的需求增加,内质网应激可通过激活JNK信号转导通路,引发胰岛素抵抗;其次,内质网还可激活NF-λB激酶抑制剂(IKK)信号转导通路,参与2型糖尿病的发生和发展[18]。此外,高血糖也能促进脂肪细胞产生大量活性氧,导致脂源性炎症因子的释放增加。本文中氧化应激状态的结果可以反映上述的机制,老年模型对照组和青年模型对照组的MDA含量高于人参低聚肽干预组和正常对照组,同时,正常对照组、人参低聚肽干预组和青年模型对照组的SOD和GSH-Px含量均显著高于老年模型对照组(P<0.05)。可见人参低聚肽可以有效降低db/db小鼠氧化应激和炎症反应。此结论与文献报道相似[7-8]。

综合图1人参低聚肽调节血糖变化的结果与炎症因子和氧化应激的结果发现,抑制炎症因子的表达和分泌,抑制氧化应激,可以减轻机体的炎症状态,从而改善胰岛素抵抗和糖代谢异常。因此,人参低聚肽通过降低老年db/db小鼠炎症反应和氧化应激来降低血糖水平。

本研究虽然未能直接检测小鼠的胰岛素敏感性,但是人参低聚肽干预的db/db的糖耐量异常改善、内脏脂肪含量减少,表明胰岛素敏感性得到了一定的改善,同时血清主要炎症因子TNF-α、IL-6的水平降低,氧化应激状态改善,这表明抑制炎症因子的分泌、降低氧化应激可能是人参低聚肽增加胰岛素敏感性和改善糖代谢异常的可能作用机制之一,而后期将对人参低聚肽如何抑制炎症因子进行深入探讨,揭示其改善糖尿病疾病状态的可能机制。

猜你喜欢
人参氧化应激脂肪
减肥后脂肪去哪儿了
脂肪竟有“好坏”之分
基于炎症-氧化应激角度探讨中药对新型冠状病毒肺炎的干预作用
反派脂肪要逆袭
清爽可口的“水中人参”
戊己散对腹腔注射甲氨蝶呤大鼠氧化应激及免疫状态的影响
人参娃娃
心情嗨起来,脂肪也一起嗨
植物化学物质通过Nrf2及其相关蛋白防护/修复氧化应激损伤研究进展
吃人参不如睡五更