色温对斑马鱼趋光行为影响的研究

邓青燕，卢克祥，钱卫国、2*，王伟杰，戴明云

(1.上海海洋大学 海洋科学学院，上海 201306；2.浙江海洋大学 水产学院，浙江 舟山 316022)

不同品系的鱼视觉特征各具特色，有些鱼类趋强光，有些鱼类趋弱光[1-5]。目前，国内外对鱼类的趋光行为研究已较为成熟，如肖炜等[6]运用水平光梯度法探索发现，奥利罗非鱼在不同光色、光强及生长阶段对光照均具有选择性；Gehrke[7]研究了麦氏鲈适宜的光照强度区间和偏好的波长范围；王以尧[1]探索了从强到弱和从弱到强两种光照强度模式下鲻的趋光性反应，发现幼鲻容易从暗适应状态过渡到明适应状态；罗会明等[8]、俞文钊等[9]对勃氏银汉鱼、孔沙丁鱼、蓝圆鰺、鲐鱼和棱鲻的趋光反应研究表明，不同的鱼均存在最适宜照度范围；巩建华等[10]研究了红鲫对环境颜色和光照强度的趋向性；许家炜等[11]研究了齐口裂腹鱼在不同工况下的光照强度阈值；罗清平等[12]探讨了孔雀鱼对不同颜色光照强度的适应范围等。

斑马鱼Daniorerio作为一种经典模式生物，近年来被广泛应用于鱼类生理代谢、遗传发育、干细胞再生、心血管毒性评价等领域的研究[13]。在斑马鱼的趋光研究方面，Oliveira 等[14]和Spence 等[15]研究了斑马鱼对环境颜色的辨别和偏好；Fernandes等[16]和Orger 等[17]研究了斑马鱼脑部的光感受器，发现大脑内部的光敏元素可影响其生理和行为；Cameron[18]运用电生理方法探讨了光感受器在斑马鱼视网膜中神经活动的生理特性；Chen 等[19]研究了斑马鱼幼体对光趋向性的时间算法。以上相关研究表明，无论是成年斑马鱼还是幼年斑马鱼均有趋向光源的行为[20-23]，表现出不同的刺激反应，对斑马鱼的视觉研究越来越多地应用于各个领域[24-26]。目前，关于斑马鱼对不同色温光源的选择及趋光反应研究鲜有报道，本研究中探究了斑马鱼在不同色温下的宏观行为反应，初步分析斑马鱼适宜的光照条件和趋光性特征，以期为人工光源应用于斑马鱼生长发育过程中的诱集、分苗及突变体的筛选培育等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用斑马鱼购自广东惠州鱼乐乐水族馆，共200尾，暂养于上海海洋大学鱼类行为学实验室，保持自然光照周期和水质清新，饲养水温为24 ℃，每日8:00和18:00定时投喂浮性膨化饲料，1 h后清除残饵和粪便并换水1/3。试验时(2019年6月)斑马鱼6月龄，体长为2.5～3.5 cm。

3种白色光源色温分别为3122K、4021K、6567 K(BPZ550-Q830.E27. 9290019009.U、BPZ600-Q840E27.9290019010.U、BPZ550-Q865E27.92900- 19022.U，昕诺飞投资有限公司，中国)，初始光效为100 lm/W，光源参数如表1所示。水下照度计1台(ZDS-10W，上海嘉定学联仪表厂)，摄像头2台(DS-2CD3T45-I3，海康威视)。

表1 白色刺激光源的光学参数Tab.1 Parameters of white stimulus light

1.2 方法

1.2.1 光源设置 试验鱼缸(240 cm×60 cm×30 cm)其中一个侧面(30 cm×60 cm)为透明面，缸底和其他面均为黑色不透光的有机玻璃面。鱼缸沿长度方向上划分为8个面积相同的区域(1～8区)，其中，1～2区表示远光区，3～4区表示弱光区，5～6区表示过渡区，7～8区表示近光区(图1)。白光光源安装在鱼缸透明面一侧，光源两侧用黑色挡板做遮光处理。刺激光源光照强度沿8区到1区由强到弱衰减，用水下照度计分别测试8个区域的光照强度(表2)，测试水深15 cm，测试位

图1 鱼缸示意图Fig.1 Diagram of a tank used in the experiment

表2 白色刺激光源在每个区域的光照强度

置为每个区域的正中心位置。为避免出现观察盲区，2台摄像头安装在鱼缸正上方，同步拍摄鱼群运动状态。

1.2.2 试验设计 本试验中采用水平光梯度法，避免自然光和环境噪声的影响，试验于20:00～24:00在暗室中进行，鱼缸水深15 cm。每种色温光源下进行一次试验，每次试验选择50尾体长一致的斑马鱼在1区暗适应30 min，暗适应时1区与2区间用黑色不透光挡板隔开，适应30 min后打开刺激光源，同时抽掉隔板，斑马鱼从暗适应状态过渡到明适应状态，摄像头开始记录鱼群的活动情况，每组记录30 min内斑马鱼在各个区域的分布情况，试验开始1 min内每5 s统计一次，其余时间每1 min统计一次。每种色温光源重复试验3次，为避免斑马鱼对光照产生适应性行为，每次试验更换不同的斑马鱼，即测试过的斑马鱼放回暂养池不再使用[27-28]，每天进行一种色温光源试验，共进行3 d。

1.2.3 指标的计算 用趋光率、趋避指数和趋光指数描述斑马鱼在不同光照条件下的行为反应。趋光率(η)表示斑马鱼在3种光照条件下各个区域的趋光反应程度;趋避指数(f)反映斑马鱼对该区域光照强度的敏感程度;趋光指数(IP)描述斑马鱼在不同光照条件下的行为反应，变化范围在[-1,1]之间，IP为正值时表示正趋光性，IP为负值时表示负趋光性。计算公式分别为

η=n/N×100%，

(1)

f=∑(L×n)/(N×Lmax)×100%，

(2)

(3)

其中：n为各分区斑马鱼分布数量(ind.)；N为试验斑马鱼总数量(ind.)；L为分区级值(1～8)；Lmax为最高级值；n1-2、n3-4、n5-6、n7-8分别为远光区、弱光区、过渡区、近光区斑马鱼分布数量(ind.)。

1.3 数据处理

参考罗清平等、杨弘等、魏开建等[12,29-30]的方法，统计记录30 min内在3种色温环境下各个区域斑马鱼分布的数量。试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。运用Origin Pro 8软件对斑马鱼在各区域的分布数量进行单因素方差分析(One-way ANOVA)， 显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 3种色温对斑马鱼趋光行为的影响

2.1.1 1 min内斑马鱼的瞬时反应 从图2可见：跟踪记录光源打开后1 min内的变化情况，斑马鱼表现出在近光源端的区域(近光区、过渡区)分布数量逐渐增加，在远离光源端的区域(弱光区、远光区)分布迅速减少的趋势；过渡区首次出现斑马鱼的时间为暖白光第5 s，早于中性光和冷白光的第10 s，即瞬时反应强度为暖白光组>冷白光组=中性光组；近光区首次出现斑马鱼的时间为暖白光第5 s、中性光第25 s、冷白光第15 s，即瞬时反应强度为暖白光组>冷白光组>中性光组，但10 s时暖白光环境下近光区斑马鱼消失，直到25 s时再次出现在近光区。

过渡区，中性光环境下斑马鱼数量在15～55 s内明显高于暖白光和冷白光，55 s后开始减少，最终低于暖白光环境；暖白光环境下斑马鱼数量在0～60 s内持续增加；冷白光环境下斑马鱼数量在0～45 s内持续增加，之后呈减少趋势(图2-A)。

近光区，在暖白光环境下斑马鱼分布数量在25～60 s内稳定上升；冷白光环境下斑马鱼数量在15～60 s内稳定上升；中性光环境下斑马鱼数量在25～55 s内稳定上升，高于暖白光和冷白光，55～60 s内数量开始减少，但依旧高于暖白光和冷白光分布数量(图2-B)。

远光区，斑马鱼分布数量在1 min内随时间的变化而减少，55 s后中性光环境下分布数量开始增加(图2-C)。

弱光区，斑马鱼分布数量总体呈先增长后降低的趋势，30～60 s内中性光环境下斑马鱼数量逐渐减少，并低于暖白光和冷白光，40～60 s内暖白光环境下分布数量逐渐减少，在1 min内冷白光环境下斑马鱼数量先增加后趋于稳定(图2-D)。

2.1.2 30 min内斑马鱼的分布 从表3可见：5 min内3种色温环境下，斑马鱼分布数量均表现为远光区>弱光区>近光区>过渡区，其中，远光区显著大于其他各区(P<0.05)；近光区和过渡区分布数量一致，均为暖白光>冷白光>中性光。随着曝光时间延长到30 min，斑马鱼对光照环境适应，继续游向光源端，近光区分布量明显增加，远光区、弱光区分布量明显减少；近光区的分布数量依次为冷白光>暖白光>中性光，过渡区分布数量依次为暖白光>中性光>冷白光。

表3 5 min和30 min内斑马鱼的分布数量Tab.3 Number distribution of zebrafish within 5 minutes and 30 minutes ind.

注：标有不同字母者表示同一时间下不同组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同Note:The means with different letters in the same time are significantly different in the different groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia图2 斑马鱼1 min内分布数量随时间的变化Fig.2 Changes in amount of zebrafish distribution in 1 min with time

从图3可见：随着时间变化，斑马鱼在4个分布区域的数量变化规律表现为近光区较高、过渡区较低、弱光区较低、远光区较高的“U”形分布；暖白光环境下，第3 min时开始出现“U”形分布，之后一直保持这种分布状态；中性光环境下第2 min时出现“U”形分布，早于暖白光环境，但第4、5 min时“U”形分布状态有短暂消失，直到30 min时分布模型均为“U”形分布；冷白光环境下，第4 min时出现“U”形分布，晚于暖白光、中性光环境，第5 min时远光区、弱光区数量增加，过渡区和近光区数量减少，“U”形分布暂时消失，直到30 min时才恢复为“U”形分布。

图3 3种色温环境下斑马鱼出现“U”形分布的时间Fig.3 Time of U-shaped distribution found in zebrafish at three color temperatures

2.1.3 5 min内各区域斑马鱼的敏感程度 暖白光环境下，近光区在5 min内趋避指数(f)持续稳定的增加，弱光区、过渡区及远光区呈现轻微的下降趋势；第3 min时近光区f值超过另外3个区域，3～5 min内各区域的f值依次为近光区>过渡区>弱光区>远光区(图4-A)。

中性光环境下，近光区f值起伏变化明显，在前3 min增长较快，第4 min时急速下降，第5 min时又回升；过渡区在刚开始3 min内下降，第4 min时近光区斑马鱼游回过渡区，指数回升；弱光区低于近光区，整体起伏变化平缓，无明显增长；远光区前4 min无明显变化，第5 min时下降，斑马鱼向光源端游动；最终f值依次为近光区>过渡区>弱光区>远光区(图4-B)。

冷白光环境下，近光区和过渡区f值表现起伏增长的模式，过渡区前4 min总体表现为增长，而第5 min时下降；而弱光区和远光区的变化趋势相同，前4 min下降，第5 min时增长，这与近光区和过渡区的变化趋势刚好相反，即斑马鱼在前4 min内对近光区和过渡区表现明显的敏感程度，且这种趋势一直在加强，第5 min时部分斑马鱼开始洄游到弱光区和远光区，但各区f值依然是近光区>过渡区=弱光区>远光区(图4-C)。

图4 5 min内各区域斑马鱼趋避指数的变化Fig.4 Changes in approach-avoidance index of zebrafish in each zone in 5 min

2.1.4 1 min内各区域斑马鱼的敏感程度 远光区，1 min内斑马鱼在3种色温下f值均表现为下降趋势，同一时间内f值依次为冷白光组>暖白光组>中性光组(图5-A)。弱光区，在中性光和暖白光环境下f值呈现先增长后减小的变化趋势，中性光光照环境25 s时f值达到最高(14.8%)，早于暖白光照环境40 s时达到最高(17.0%)，此时斑马鱼对弱光区趋向性最强，冷白光照环境下0～35 s时呈现增长模式，35～45 s时略微下降，随后继续增长，60 s时f值达最高(17.4%)(图5-B)。过渡区，3种色温光照环境下的f值随时间变化增大，整体上f值依次为中性光组>暖白光组>冷白光组，斑马鱼对暖白光环境的敏感度一直加强，中性光的敏感程度总体上加强，但在45 s和60 s时出现减弱趋势，而冷白光环境下敏感程度先增强，45 min后出现减弱趋势，敏感程度降低(图5-C)。近光区，在3种色温环境下的f值均呈现上升趋势，20～35 s内f值增长较为缓慢，30 s后快速增长，斑马鱼对近光区的敏感程度明显增强，f值依次为中性光组>冷白光组>暖白光组，60 s时中性光环境下斑马鱼有回避的趋势，敏感程度出现降低的情况(图5-D)。

图5 1 min内各区域马鱼趋避指数的变化Fig.5 Changes in approach-avoidance index of zebrafish in each zone in 1 min

2.2 3种色温光源光照强度对斑马鱼趋光率的影响

光源开启后，斑马鱼表现出明显的惊愕反应，迅速逃离暗光区，随后缓慢游向光源区，逐渐稳定。从表4可见：光照强度为0～100 lx时，3种色温环境下斑马鱼分布较为密集，冷白光和中性光组斑马鱼数量显著高于暖白光(P<0.05)；当光照强度为100～200 lx时，斑马鱼分布无显著性差异(P>0.05)；当光照强度为200～400 lx时，暖白光和冷白光色温组斑马鱼分布数量有显著性差异(P<0.05)，斑马鱼分布数量为暖白光组>中性光组>冷白光组；当光照强度为400～900 lx时，各组斑马鱼分布量均减少，其中，暖白光色温组数量显著高于中性光(P<0.05)；当光照强度为900～2000 lx时，3种色温环境下斑马鱼分布量均无显著性差异(P>0.05)，分布数量为冷白光组>暖白光组>中性光组。3种不同色温环境下，冷白光组和暖白光组相比，在较低光照强度(0～100 lx)和较高光照强度(900～1200 lx)条件下，斑马鱼偏向冷白光，中等光照强度(200～900 lx)时更偏向暖白光。

表4 3种色温环境下斑马鱼的趋光率(η)Tab.4 Phototaxis for illumination intensity of zebrafish for three color temperature conditions

2.3 3种色温光源对斑马鱼趋光指数的影响

趋光指数IP为正表示正趋光性，IP为负表示负趋光性，3种色温的光照环境下，斑马鱼在打开刺激光源30 min内的IP如图6所示。斑马鱼对3种色温光源的趋光性表现差异明显，打开光源后，斑马鱼从暗适应状态过渡到明适应状态，前5 min内表现为负趋光性，似有回避的迹象。随着时间延长，在第10 min时，斑马鱼开始适应暖白光光照环境，表现为正趋光性，并且这种趋向性越来越明显，IP值一直增大。在中性光光照环境下，可以观察到前25 min内斑马鱼均表现为明显的负趋光反应，对该光照环境极为不敏感，25 min后斑马鱼才逐渐适应该环境，表现为正趋光性。在冷白光光照环境下，打开光源后10 min内斑马鱼存在一个回避适应的过程，表现为负趋光反应，在15～25 min内，斑马鱼对该光照环境表现出持续增强的正趋光性，到30 min时IP值为负表现为负趋光性。可以看出，前期斑马鱼在打开光源后，需要一个适应期接受相应的光照环境，暖白光适应时间最短，冷白光次之，中性光适应时间最长。

图6 3种色温环境下斑马鱼的趋光指数Fig.6 Phototaxis index of zebrafish under three color temperature conditions

3 讨论

3.1 斑马鱼对3种光源的敏感特性分析

不同种类的水生动物对光照波长、色温及光照强度的敏感性不同。本试验中，打开光源瞬间，斑马鱼会有一个称为惊吓反应的活动高峰[31]，斑马鱼对3种光源环境的瞬间反应明显表现为暖白光敏感程度最强，冷白光次之，中性光敏感程度最弱。随着时间变化，过渡区和近光区斑马鱼不断增加，远光区和弱光区斑马鱼持续减少。可以看出，在开灯瞬间，即短时间内，斑马鱼对暖白光瞬间反应最强，其次是冷白光，中性光最低；随后斑马鱼逐渐适应3种光环境，反应普遍增强，尤其是对中性光环境的反应增强趋势较稳定，且对中性光环境反应表现最强，其次是暖白光。在整个适应调节过程中，斑马鱼对中性光的反应表现出稳定增强的变化趋势，但是在55 s时出现斑马鱼洄游情况，反应程度开始减弱，而另外两种光环境则继续表现增强的状态。初步分析其反应特征，斑马鱼对暖白光瞬时反应强烈，在明暗环境交替瞬间，相较于中性光和冷白光，斑马鱼能更快速地从暗环境适应状态下切换到暖白光环境。随着时间延长，对中性光反应增强幅度最大，持续时间短，冷白光和暖白光环境下斑马鱼反应也随时间变化增强，幅度低于中性光，但是持续的时间较中性光长。

本试验中所用的白色光源是由不同成分的单色光组合成的复合光，测试3种色温光源的光源参数发现，白色光源的组成成分间有明显的差异(表1)。而国外学者在对斑马鱼的颜色偏好性、可见光的趋光性及紫外光的避光性研究中，证实斑马鱼视觉器官中存在4色视网膜，具有4色性颜色视觉能力，吸收峰值分别是363、415、480、570 nm[15,18,26,32-33]，即斑马鱼对可见光中的红色、绿色、蓝色光敏感。但Brockerhoff等[34]研究表明，红色敏感的视锥细胞会在初期形成后迅速消失，出现对这种色彩的选择性失明。因此，斑马鱼对不同色温白光的敏感反应特征，还需要结合光感受器在斑马鱼发育过程中的表达情况展开进一步研究。

3.2 斑马鱼在白色光源环境下的“U”形分布特征

色温是白光光源的重要参数，不同色温光源对水生动物的生活行为有重要的影响。本试验中选择暖白光、中性光、冷白光3种色温的光源为刺激光源，研究了斑马鱼在3种环境下的趋光行为，分析30 min的观察结果表明，3种色温环境下斑马鱼的分布特征最终均表现为鱼缸首尾两端分布量明显高于中间分布量，即“U”形分布(表3、图3)。魏开建等[30]在鳜鱼趋光特性的研究中也发现，无论哪个发育时期，鳜鱼均趋于选择光箱两端的暗区或亮区，由此认为鳜鱼是根据照度的相对值而非绝对值选择照度[35]；巩建华等[10]对红鲫趋光性探究过程中发现了相似的分布特征，无论哪种颜色光照下，红鲫鱼均会优先选择鱼缸左右两侧，红鲫具有靠边生活的习性，这很有可能是导致此结果的原因；方金等[36]研究网箱养殖大黄鱼对颜色和光强的反应时，同样发现在远离灯源的4区和近灯源的1区分布密集，而2、3区分布较低的情况。本试验形成“U”形分布的过程中，斑马鱼体现的不是单一的正趋光性或负趋光性，可能与斑马鱼的群聚生活习性相关，聚集在鱼缸两端相对中间区域较安全，这需要通过设计斑马鱼对不同波长光照的趋光反应来进一步证实。

3.3 光照时间对斑马鱼趋光行为的影响

鱼类行为学研究中，不同种类鱼有不同的试验时间。本试验周期设定为1 h，暗适应时间为30 min，测试观察时间为30 min，通过观察分析发现，光源开启早期，斑马鱼对暖白光环境反应敏锐，对中性光光照环境反应略微迟钝，但随着时间延长，逐渐适应中性光环境，聚集在中性光环境下的斑马鱼数量明显高于暖白光和冷白光环境；而且斑马鱼在开灯初期对3种光照环境均表现出负趋光性，在持续光照条件下，最终表现为一个稳定的变化趋势。这说明斑马鱼在不同时间段对光反应有不同的行为特征，只在特定时间内表现出正趋光性或负趋光性，且对3种光照环境的适应周期也依据光源色温而不同。郭柏福等[37]在研究中华鲟子二代仔鱼对光照强度的趋性行为时也设定30 min为试验周期，发现中华鲟子二代仔鱼在特定的时间段具有趋光性，随时间延续，中华鲟会逐步适应不同光照强度。

视觉正常的斑马鱼经过一段时间暗适应后，打开光源，周围环境立即有一个明暗转变，斑马鱼会做出迅速逃离这个区域的动作[20]，即斑马鱼惊吓反应的时间。本研究中通过分析1 min内斑马鱼群的行为反应可知，暖白光环境下仅需要5 s，斑马鱼就在近光区出现，这种现象与Mueller等[3]描述的结果一致，在正向的趋光性过程中，斑马鱼首先转向光源，然后迅速靠近光源。这种明显的快速活动，取决于刺激光源的特性，在本试验中3种特性的白光，冷白光下需要15 s，而中性光需要25 s。在负向的趋光性过程中，斑马鱼首先远离光源然后再缓慢移向别处，在30 min的试验周期内体现出逐步转变的过程。

4 结论

(1)斑马鱼在3种色温环境下表现出不同程度的趋光反应，斑马鱼对暖白光的瞬间反应程度最明显，相较于中性光和冷白光，斑马鱼能更快速地从暗适应状态切换到暖白光环境；

(2)短时间光照条件下斑马鱼对中性光最敏感，其次是冷白光和暖白光，但随时间延长，斑马鱼在适应光照的过程中对暖白光表现为缓慢加强的正趋光性；

(3)长时间光照时斑马鱼在暖白光光照下最为舒适，而中性光和冷白光短时间内表现出快速吸引斑马鱼的优势。