宫颈癌组织中微小RNA-585、性别决定区Y-box 9 mRNA的表达变化及其临床意义

朱军，姚超

十堰市妇幼保健院，湖北十堰 442000

宫颈癌是全球女性中第二大常见肿瘤，也是肿瘤相关死亡的第四大原因[1]。尽管目前已经使用包括手术、化疗、放疗和靶向治疗在内的综合治疗来改善宫颈癌患者的临床症状，但是患者的预后仍然不满意，5年生存率较低，约为40%[2]。因此新的宫颈癌治疗手段迫切需要研究。微小RNA(miRNA)是一类由19～25个核苷酸组成的新型小型非编码RNA，可参与细胞发育、增殖、转移、代谢、分化、细胞周期和凋亡等生物学过程[3]。近几十年，miRNA在肿瘤中的生物学功能成为肿瘤研究的热点，可以作为肿瘤治疗靶点抑制恶性肿瘤进展[4]。miR-585是新近发现的miRNA之一，首次在非小细胞肺癌(NSCLC)中被报道，被认为是NSCLC复发的预后标志物[5]。miR-585可抑制结直肠癌、NSCLC和胃癌的发生发展[6]，miR-585在宫颈癌中的研究未见有报道。此外miRNA可通过降解mRNA或抑制翻译在转录后水平调节靶基因表达，生物学软件预测性别决定区Y-box 9(SOX9)可能是miR-585的靶基因，SOX9在不同的肿瘤中的表达水平及发挥的作用不同[7]，同时在宫颈癌中发挥的作用仍有争议[8]。我们观察了宫颈癌组miR-585、SOX9 mRNA的表达变化情况，并探讨其临床意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月～2014年1月期间我院诊治的宫颈癌患者80例(观察组)，年龄30～62(45.87±12.63)岁，>50岁者52例，≤50岁者28例；宫颈鳞癌48例，腺癌32例；FIGO分期为ⅠA2期10例，ⅠB1期19例，ⅠB2期22例，ⅡA1期18例，ⅡA2期11例；组织学分级为中高分化45例，低分化35例；淋巴结转移23例，无淋巴结转移57例；浸润深度：浅肌层例37例，深肌层43例。纳入标准：初次诊治，未接受过放化疗、免疫治疗及靶向治疗等抗肿瘤治疗；穿刺活检或术后组织经2位病理专家明确诊断为宫颈癌；完整的临床病例资料和随访资料。及排除标准：合并其他恶性肿瘤；患有严重的宫颈炎；患有威胁生命健康的全身性疾病。另选择宫颈良性病变(子宫肌瘤)组织40例作为正常对照组，年龄35～58(47.36±9.24)岁，两组年龄具有可比性。两组均行手术切除肿瘤或子宫肌瘤，术中保存保留宫颈癌及宫颈良性病变组织。本研究伦理由我院伦理委员会审核通过，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 DP501 miRcute miRNA 提取分离试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自美国Thermo公司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-585、SOX9、内参U6和GAPDH引物由美国Invitrogen公司合成；Nanodrop2000分光光度仪购自美国Thermo公司；7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 宫颈癌及宫颈良性病变组织miR-585、SOX9 mRNA检测 应用qRT-PCR法。手术中切除新鲜病理组织快速置于-80 ℃液氮冻存后，按照miRNA 提取分离试剂盒说明书提取组织中总的RNA，测得RNA的浓度和纯度后，放置-80 ℃冰箱保存备用。以提取的总RNA为模板，按照逆转录试剂盒进行逆转合成cDNA。以cDNA为模板，按照qPCR试剂盒说明书配制反应体系，反应条件为：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃，30 s，40个循环。每个样品设置3个反应复孔，得到各样品的循环阈值(threshold cvcle，Ct)。以U6基因为内参，以2-ΔΔCt代表miR-585相对表达量，其中ΔCt=CtmiR-585-CtU6。以GAPDH基因为内参，以2-ΔΔCt法代表SOX9 mRNA相对表达量，其中ΔCt=CtSOX9-CtU6。miR-585引物F: 5′-ACGCGTTCTCCTTACCATCCCTGA-3′, R: 5′-CGATCTGGAAGTAACCCAAGCC-3′；SOX9引物F: 5′-AGCGAACGCACATCAAGAC-3′, R: 5′-CTGTAGGCGATCTGTTGGGG-3′；内参U6引物F: 5′-GATTCCTATGTGGGCGACGAG-3′, R: 5′-CCATCTC-TTGCTCGAAGTCC-3′。内参GAPDH引物F: 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′, R: 5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。

1.4 随访方法 观察组术后每1～3个月随访1次，由专业随访人员采用电话及门诊的方式进行，随访时间为术后60个月，直至患者死亡或者截止到随访时间2019年1月。收集数据，计算患者生存时间。

1.5 miR-585与SOX9靶向关系的预测 利用Target Scan7.2生物学信息软件(tp://www.targetscan.org/vert_72/)预测miR-585与SOX9靶向关系。

2 结果

2.1 两组miR-585和SOX9 mRNA相对表达量比较 观察组、对照组miR-585相对表达量分别为0.83±0.39、1.00±0.36，二者比较，P<0.05；观察组、对照SOX9 mRNA相对表达量分别为1.00±0.48、1.46±0.75，二者比较，P<0.05。

2.2 miR-585、SOX9 mRNA表达与宫颈癌组织患者临床病理参数之间的关系 见表1。miR-585、SOX9 mRNA的表达与宫颈癌患者的年龄、组织类型和组织学分级均无关(P均>0.05)，与宫颈癌患者FIGO分期、淋巴结转移和浸润深度显著相关(P均<0.05)。见表1。

表1 不同临床病理参数的宫颈癌患者癌组织 miR-585、SOX9 mRNA表达

2.3 宫颈癌组织中miR-585、SOX9 mRNA表达对患者预后的影响 80例宫颈癌患者成功随访73例，有7例失访病例，共45例患者5年内死亡，5年生存率为38.36%(28/73)。

按miR-585在宫颈癌组织中的相对表达量平均数0.83为界，将80例宫颈癌患者分为miR-585低表达患者(41例)和miR-585高表达患者(39例)，绘制Kaplan-Meier生存曲线，miR-585低表达组失访3例，38例中死亡29例，5年生存率为23.68%(9/38)；miR-585高表达组失访4例，35例中死亡16例，5年生存率为54.29%(19/35)；与miR-585高表达患者相比，miR-585低表达患者预后较差(χ2=7.11，P=0.008)。按SOX9 mRNA在宫颈癌组织中的相对表达量平均数1.46为界，将80例宫颈癌患者分为SOX9低表达患者(49例)和SOX9高表达患者(31例)，绘制Kaplan-Meier生存曲线，SOX9低表达组失访4例，45例中死亡23例，5年生存率为48.89%(22/45)；SOX9高表达组失访3例，28例中死亡22例，5年生存率为21.43%(6/28)；与SOX9mRNA低表达患者相比，SOX9mRNA高表达患者预后较差(χ2=6.57，P=0.010)。

2.4 miR-585与SOX9mRNA靶向关系 SOX9的3′UTR区存在miR-585的结合位点。见图1。

图1 miR-585与SOX9的3′UTR区的结合位点

2.5 miR-585和SOX9mRNA在宫颈癌组织中表达相关性 miR-585与SOX9mRNA在宫颈癌组织中的表达呈负相关(r=-0.315，P=0.006)。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一[1]。其中，34～44岁年龄组女性是宫颈癌高发人群。由于宫颈癌患者早期症状不明显，晚期患者出现迄今已确定的两种转移类型，包括淋巴结和远处器官的转移，使得目前宫颈癌的治疗手段有限，达不到预期的治疗效果，转移性宫颈癌预后十分差，中位生存期仅为8～13个月，与其他肿瘤一样，转移进展是宫颈癌治疗的难点[9]。针对晚期患者的分子靶向药物开启了恶性肿瘤的全新治疗治疗模式，宫颈癌现有的分子靶向药物并不能达到理想的临床治疗效果，在现有的治疗基础上寻找不同的分子靶向药物，实施联合治疗的方法为宫颈癌的治疗提供新的方向[10]。目前人乳头瘤病毒HPV被认为是宫颈癌主要的致病因子，超过99%的宫颈癌患者持续存在HPV感染，此外还有许多与致癌作用有关的危险因素[11]，但是宫颈癌的发病机制尚未完全明确，因此探索宫颈癌进展过程的分子机制对于新型治疗靶标的开发是迫切需要的。

已知超过四分之一的人类miRNA在至少一种肿瘤类型中显著失调，这表明miRNA可能代表肿瘤恶性进展过程中新型基因调节因子之一[12]。已经在多种类型的肿瘤中鉴定出miRNA异常表达谱，这些成千上百个表达失调的miRNA可以通过作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥致癌作用[4，5]。越来越多的研究表明，各种miRNA参与了宫颈癌的进展，是宫颈癌潜在的治疗靶点和预后生物标志物[6]。miR-585是众多抑癌因子之一，目前关于miR-585的研究较少，Chen等[13]报道miR-585表达升高参与冠状动脉疾病的发生；循环肿瘤RNA_102958通过miR-585/CDC25B轴在结直肠癌中发挥新型致癌作用[8]；在NSCLC组织和细胞系中miR-585的表达下调，miR-585的异位表达在体外抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的能力以及在体内miR-585降低了裸鼠中异种移植肿瘤的生长速度[9]。而miR-585在宫颈癌中的表达情况未知，本文采用qPCR检测发现miR-585在宫颈癌组织中表达下调，并与患者的FIGO分期、淋巴结转移、浸润深度和生存预后较差显著相关，可能是抑癌因子，与miR-585在胃癌组织和细胞系中表达下调，并且miR-585的表达与胃癌侵袭程度、TNM分期、淋巴结侵袭和预后不良相关的结果[10]相似。本研究结果提示miR-585可能是宫颈癌预后不良生物标志物和治疗候选靶标。

成熟miRNA是通过与靶基因的3′非翻译区(UTR)内的种子位点互补结合引起mRNA的降解或翻译抑制来参与多种信号传导途径的调控[4]。miRNA的靶基因不止一个，在肿瘤中已经证实的miR-585靶基因有CDC25B、hSMG-1和MAPK1[8]，我们采用Target Scan7.2生物学信息软件发现SOX9的3′UTR区存在miR-585的结合位点，可能是miR-585的靶基因。SOX9属于SOX家族成员之一，由DNA结合结构域组成，包括保守的高迁移率基团(HMG)。SOX9是HMG-box类中的转录因子，影响细胞的存活、增殖和分化，SOX9依赖于肿瘤的来源可以作为癌基因和肿瘤抑制因子[11，12]。而目前SOX9在宫颈癌中的报道不一致，研究[13]发现，与正常宫颈组织相比，原位宫颈癌尤其是浸润性宫颈癌中SOX9的表达逐渐降低。SOX9的过表达抑制体外细胞生长和体内肿瘤形成，为抑癌基因。Liu等[8]报道SOX9在宫颈癌组织中表达增加，并作为miR-215-3p的靶基因促进宫颈癌的进展。此外，SOX9表达升高促进宫颈癌细胞对顺铂的化学耐药[9]。本文采用qPCR检测发现SOX9在宫颈癌组织中表达上调，并与患者的FIGO分期、淋巴结转移、浸润深度和生存预后较差显著相关，可能是促癌因子，与Liu等[8]的研究一致，而与研究[13]相反，可能是样本来源和样本量等不同导致的。同时我们分析了miR-585和SOX9两者在宫颈癌组织中的表达相关性，结果显示两者表达呈负相关性，表明miR-585可能通过负调控SOX9抑制宫颈癌进展，但其具体作用机制仍需后续探讨。

综上所述，宫颈癌组织中miR-585表达增加，SOX9 mRNA表达降低，两者表达呈负相关性，miR-585可能通过靶向SOX9 mRNA抑制宫颈癌的进展。miR-585 和SOX9 mRNA均与患者不良预后相关，可能是宫颈癌患者预后不良的生物标志物和治疗的新型靶点。