超高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中90 种那非类药物

马俊美,王 敬,孙文毅,蒋 杰,李 强,范素芳

(河北省食品检验研究院,河北省食品安全重点实验室,河北 石家庄 050091)

保健食品能调节人体机能,是对人们正常膳食的有益补充[1],随着社会经济的发展和亚健康人群的增加,保健食品市场销量与日俱增。近年来该行业持续发酵,呈现较为混乱的局面[2],一些不法商家为突出功效,吸引消费者,谋取高额利润,在产品中非法添加短期内见效快、成本低廉、副作用大的化学药物[3-4],为消费者的健康埋下了隐患。其中补肾壮阳类保健品是非法添加的重灾区,非法添加的壮阳类药物主要是以西地那非为代表的那非类物质[5-6],该类化合物将给消费者带来严重的健康威胁,产生心律失常、心肌梗死、心脏猝死、脑血管出血、高血压等严重不良反应[7-9],患有高血压等心血管疾病和糖尿病患者在不知情的情况下服用这些非法添加化学成分的药物甚至会导致死亡[10]。

目前,保健食品中那非类物质的检测方法有薄层色谱法[11-12]、液相色谱法[13-16]、液相色谱-高分辨质谱法[17-21]和高效液相色谱-串联质谱法[22-26]等。其中,薄层色谱法前处理复杂,干扰大且容易出现假阳性;液相色谱法检测的物质较单一,且检出限较高。随着分析检测技术和分析仪器的不断发展,具有高选择性和高灵敏度,且定量准确,操作简便的高效液相色谱-串联质谱法得到广泛应用[27-28],己成为那非类物质的主要检测方法[29-31]。目前,基于高效液相色谱-串联质谱法检测那非类物质的种类较少(30 种以下),不够全面,检测30 种以上那非类物质均采用高分辨质谱法,侧重于定性筛查[32]。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法,建立可能被添加的90 种那非类物质的测定方法,该方法前处理简单、灵敏度高、准确性好,适合大批量样品中那非类物质的快速测定,不仅为开展食品检验工作提供技术支撑,也对打击制、售假冒伪劣保健食品,净化保健食品市场产生重要影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

固态和液态保健食品 市售。

甲醇、乙腈、甲酸(均为色谱纯) 德国默克公司;超纯水 广州屈臣氏公司;90 种那非类药物混标(20 μg/mL) 北京曼哈格生物科技有限公司。

Triple Quad 6500+液相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源及MultiQuant3.0.2数据处理系统) 美国Sciex公司;3K13离心机 德国Sigma公司;Vortex Genius 3涡旋仪 德国IKA公司;Elmasonic P300H超声波清洗器德国Elma公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

固态试样混匀研细,液态试样摇匀后,准确称取1.00 g样品于25 mL容量瓶中,加入20 mL甲醇,超声提取15 min,放置室温后,用甲醇定容,转移至50 mL离心管中,9 500 r/min离心2 min,上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤,取滤液,根据实际浓度用甲醇适当稀释至线性范围内,待测。

1.2.2 色谱条件

XBridge BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm);流动相A为0.1%甲酸溶液,B为乙腈;进样体积5.0 μL;柱温40 ℃;流速0.3 mL/min;梯度洗脱程序:0～2.00 min,90% A,10% B;2.00～16.00 min,90%～35% A,10%～65% B;16.00～19.00 min,35%～2% A,65%～98% B;19.00～22.00 min,2% A,98% B;22.00～22.10 min,2%～90% A,98%～10% B;22.10～25.00 min,90% A,10% B。

1.2.3 质谱条件

电喷雾离子源;扫描方式:多反应监测;离子喷雾电压4 500 V/-4 500 V;雾化器压力50 psi;辅助气压力50 psi;气帘气压力30 psi;碰撞气压力9 psi;离子源温度500 ℃。监测离子及质谱参数见表1。

表1 分析物的质谱信息Table 1 Mass spectrometry parameters of analytes

续表1

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

以针泵进样的方式,以5 μL/min的流速向质谱仪中注入100 ng/mL那非类物质标准溶液,确定其最佳质谱条件。分别在正、负离子模式下进行一级全扫描,确定目标化合物的母离子质量数。实验中发现,除脱哌嗪基硫代西地那非和伐地那非二聚体在负离子模式下的灵敏度远高于正离子模式外,其余88 种那非类物质均在正模式下的响应更高,这是由于这些物质的分子结构中均含有仲胺或叔胺等基团,适合正电离模式。确定目标化合物的母离子后,对母离子进行子离子全扫描,确定其定性和定量离子。优化子离子的去簇电压,碰撞能量等参数。目标化合物的定性和定量离子对的质谱检测参数见表1。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 流动相的选择

采用正、负2 种离子模式采集,实验对比了分别在乙腈-水、甲醇-水流动相体系中不添加与添加0.1%甲酸、氨水时,90 种那非类物质的色谱峰形和离子化程度。结果发现,采用0.1%甲酸-乙腈体系时,90 种那非类物质的离子化效果普遍较好且峰形最佳,这是由于90 种那非类物质中除脱哌嗪基硫代西地那非、伐地那非二聚体外,其余均采用正离子模式采集,加入适量的甲酸会促进胺的电离,从而提高离子化效率,后续实验选用0.1%甲酸-乙腈体系作为流动相。

2.2.2 色谱柱的选择

90 种那非类物质中,母离子相同二级子离子相同或部分相同的同分异构体共有8 组,分别为母离子m/z357.2的那非乙酰酸和那莫伐地那非;母离子m/z438.2的苯噻啶红地那非和伐地那非乙酰基类似物;母离子m/z467.3的红地那非、二甲基红地那非和乙酰伐地那非;母离子m/z475.2的伐地那非哌嗪酮和N-去乙基-N-甲基伐地那非;母离子m/z489.2的艾地那非、豪莫西地那非、伐地那非、丙氧苯基西地那非和异丁基西地那非;母离子m/z505.2的羟基伐地那非和伐地那非N-氧化物;母离子m/z519.2的丙氧苯基羟基豪莫西地那非、丙氧苯基硫代艾地那非和丙氧苯基硫代豪莫西地那非;母离子m/z521.2的羟基硫代豪莫西地那非和羟基硫代伐地那非。

为使每种目标物都有较好的峰形和分离效果,本实验选择质量浓度为20 ng/mL的90 种那非类物质标准溶液,在相同的流动相和洗脱程序下,分别采用Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、XBridge BEH Shield RP18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μ m) 、 T h e r m o A c c u c o r e a Q C18色 谱 柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)、Hypersil Gold C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm)进行分离实验。结果表明:使用Thermo Accucorea Q C18和Hypersil Gold C18色谱柱时,豪莫西地那非和伐地那非不能分离,使用XBridge BEH Shield RP18色谱柱时育亨宾出峰稍有拖尾,使用Waters Acquity BEH C18色谱柱时,色谱峰峰形良好,且8 组同分异构体(图1)分离效果较为理想,故实验选择Waters Acquity BEH C18色谱柱进行分离。

图18 组同分异构体的液相色谱-质谱图Fig. 1 Extracted ion chromatograms of 8 sets of isomers

2.3 前处理条件优化

90 种那非类物质均难容或不溶于水,易溶于极性有机溶剂,实验对比目标物添加量为50 μg/kg时,甲醇、乙腈和乙醇3 种溶剂的提取效果。结果表明:采用甲醇和乙腈作为提取溶剂的效果优于乙醇,二者提取结果基本一致,综合考虑溶剂毒性、成本等问题,最终选用甲醇作为提取溶剂。

2.4 线性范围、检出限和定量限结果

用上述优化的条件对保健食品中90 种那非类物质进行定量分析,用甲醇稀释标准溶液储备液,得到系列标准工作溶液,以目标物定量离子的色谱峰峰面积为纵坐标(Y),目标物质量浓度为横坐标(X)作线性回归方程,以3 倍和10 倍信噪比对应的空白样品添加质量浓度作为检出限和定量限。如表2所示,90 种那非类物质在0.2～50 ng/mL质量浓度范围内相关系数(r2)大于0.995,线性关系良好。检出限为2.5～25.0 μg/kg,定量限为5.0～50.0 μg/kg,远低于现有文献方法与标准方法(BJS 201805)。

表2 90 种化合物的线性关系、检出限、定量限Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of 90 compounds

续表2

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2.5 回收率和精密度结果

在固态、液态空白基质中添加90 种那非类物质标准溶液制成阳性样品,添加水平分别为1 倍定量限、3 倍定量限和10 倍定量限,每个添加水平进行6 次重复实验,计算回收率和相对标准偏差(relative standard deviations,RSD),回收率结果见表3。添加量为5.0～500 μg/kg时,90 种那非在固态样品中回收率为78.0%～109.9%,RSD为0.20%～9.96%,在液态样品中回收率为80.5%～109.8%,RSD为1.25%～7.34%,符合检验方法要求。

表3 90 种化合物的回收率Table 3 Spiked recoveries of the 90 compounds%

续表3%

续表3 %

2.6 实际样品检测结果

应用本研究建立的方法对市场以及网上购买的10 批次固态和液态保健食品进行检测,结果发现有1 批次保健酒样品检测出含有西地那非(2.83×105μg/kg)、1 批次片剂样品检测出含有他达拉非(3.85×106μg/kg)。

3 结 论

本研究建立超高效液相色谱-串联质谱检测保健食品中90 种那非类物质的分析方法,并进行方法学验证。该方法简单高效、选择性好、灵敏度高,满足大量保健品中那非类物质快速、准确定量的需要。可为基质中那非类物质的检测提供方法参考,也可为打击保健食品行业非法添加化学药物行为提供有利依据。