香辣仔鹅特定腐败菌的分离及鉴定

彭先杰，陈崇艳，袁玉梅，于跃，刘永明，袁先铃

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 自贡 643000)

鹅肉富含人体多种必需氨基酸、维生素、蛋白质、烟酸、微量元素钙、铁、磷等[1]，有少量的脂肪，且99%以上为不饱和脂肪酸，具有较高的食用价值和药用价值[2]，是受人瞩目的营养食品[3]。鹅属草食性家禽, 有抗逆性强、适应性广、产品综合利用价值高等特点[4]，其中，鹅肉干物质含量比鸭肉高7.8%，比鸡肉高20.5%；0.1 kg鹅肉产能是鸭的1.3倍，鸡的2.6倍[5]。2009年，中国肉鹅出栏量约为6.05亿只[6]；2012年，出栏数量约为6.29亿只，占世界总量的90%以上[7]，2014年约为9.0亿只[8]，我国的鹅饲养量位居世界首位[9]，在国际市场上有巨大的消费潜力。

香辣仔鹅属于熟肉制品(GB 2726—2016)，鹅肉具有高蛋白、低胆固醇、多不饱和脂肪酸等特点，肉质细嫩，口味独特，营养丰富。香辣仔鹅经过一系列的干制、蒸煮、熏烤、酱卤等加工工艺后，可直接供人食用[10-12]，但是在加工、运输、贮藏以及销售过程中因高水分、高蛋白等极易被微生物污染，导致腐生葡萄球菌、溶酪大球菌、芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、肉杆菌属群、梭菌属群、沙门氏菌属、肠杆菌及乳酸菌等微生物含量超标[13-21]，甚至会导致食源性病菌感染引起各种疾病以及食物中毒[22-24]，从而危害人体健康。

随着时代的快速发展，人们对肉类品质的要求越来越高，开展冷吃鹅肉加工质量安全关键技术等研究势在必行。本实验以香辣仔鹅为研究对象，分析其贮藏期间微生物变化，将其分离纯化，通过菌落总数和挥发性盐基氮确定特定腐败菌。根据生理生化方法研究特定腐败菌的生物学特性，结合分子生物学进行菌株鉴定，为如何抑制冷吃鹅肉中特定腐败菌的生长提供了理论基础，也为其他熟肉制品的保鲜技术提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹅肉、香辛料等：购于宜宾市沃尔玛超市。

香辣仔鹅制备过程：鹅肉切丁、腌制、炒制、冷却、装袋、抽真空(接触性工具皆用75%酒精消毒)。

无水葡萄糖、氯化钠、三氯乙酸、氧化镁、结晶紫、草酸铵、α-萘酚、氢氧化钾、可溶性淀粉、乳糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸钠、磷酸二氢铵、对二甲基氨基苯甲醛、硝酸钾、过氧化氢、磷酸二氢钾、苯酚红等分析纯；胰蛋白胨、酵母浸膏、琼脂、石蜡油、牛肉膏、D-麦芽糖、明胶、尿素等生物试剂；甲基红、溴百里酚蓝等指示剂。

1.2 仪器与设备

LS-75HD立式压力蒸汽灭菌器(配备国家专利安全连锁装置及超压自动保护功能) 江阴滨江医疗设备有限公司；Kje1tec 8400全自动凯氏定氮仪(配备专用计算机软件管理及进样器系统) 福斯分析仪器公司；UV-8000ST触屏版双光束紫外可见分光光度计(配置双光路、双光束光学系统及高性能进口光栅) 上海元析仪器有限公司；ABI 3730XL测序仪(配置双光束双侧激光激发，光栅分光装置和后置超薄CCD检测成像系统) 美国基因仪器公司；2720 Thermal Cycler PCR仪(配置VeriFlexTM模块控制系统) 美国应用生物系统(ABI)公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株腐败特性实验

菌株的分离与筛选：在无菌环境条件下，取37 ℃恒温培养15 d的3袋变质香辣仔鹅产品10 g(产品出现哈败味，肉质明显变软)，制成10-1～10-7的菌悬液，选择最后5个稀释度的菌液接种到牛肉膏蛋白胨琼脂(beef extract peptone agar)平板；挑选培养基中较典型的菌落于平板计数琼脂(plate count agar，PCA)平板上划线，直至分离得到纯菌落，将分离的菌株编号为A～H。

菌株的复筛：将纯化后的A～H菌株制成菌悬液，分别取1 mL加入灭菌后的无菌香辣仔鹅中，37 ℃培养24，48 h；测定菌落总数(total volatile basic nitrogen)和挥发性盐基氮(TVB-N)(测定3次取平均值)[25，26]，确定菌株的致腐能力，将有较强致腐能力的菌株作为特定腐败菌。

1.3.2 特定腐败菌的生理生化鉴定

对特定腐败菌分别进行革兰氏染色[27]、生长温度与耐热性试验、V-P(乙酰甲基甲醇)试验、淀粉水解试验、碳源利用试验、吲哚试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、尿素水解试验、石蕊牛乳试验，以上试验步骤参考《常见细菌系统鉴定手册》[28]。

1.3.3 特定腐败菌的分子生物学鉴定

将特定腐败菌在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)体系中扩增。16S rDNA基因扩增引物上、下游序列分别为：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′。 PCR反应体系：25 μL的I5 Mix，1 μL的PF(10P)，1 μL的PR(10P)，1 μL的Genomic DNA，22 μL的dH2O。PCR扩增条件：94 ℃、5 min，98 ℃、10 s，53 ℃、15 s，72 ℃、20 s(98，53，72 ℃共35个循环)，72 ℃、5 min，于4 ℃保存。将PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收，送成都肇科生物科技有限公司进行测序鉴定。

1.4 数据处理

根据测序鉴定结果，在NCBI数据库中进行BLAST对比分析，找到相似菌属(种)后，用MAGE 7软件绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 腐败细菌分离纯化结果

2.1.1 腐败菌株的分离

经过多次平板划线分离纯化，总共得到8种菌株，命名A～H，观察平板上的菌落形态，结果见表1。

表1 分离菌株的菌落形态Table 1 The colony morphology of isolated strains

续 表

2.1.2 菌落总数测定结果

在恒温恒湿培养箱37 ℃培养24，48 h，各个菌株的菌落总数平均值测定结果见表2。

表2 分离菌株的菌落总数Table 2 Total bacterial colony number of isolated strains

食品菌落总数是用来判断食品的新鲜度、食品的卫生质量以及该食品被细菌污染的程度，它可以反映食品在生产、运输及销售过程中是否符合国家卫生标准，菌落总数的多少在一定程度上表示着食品质量的优劣(GB 4789.2—2016中，细菌的菌落总数≤105CFU/g)[29,30]。由表2可知，培养24 h，A，C，D，H菌株的菌落总数超标；培养48 h，菌株的菌落总数全部超标。

2.1.3 TVB-N测定结果

TVB-N是指动物性食品在腐败过程中，由于酶和细菌的作用，使蛋白质分解，并产生氨以及胺类等碱性含氮物质[31]。此氨及胺类碱性物质具有挥发性，其含量的高低反映了氨基酸被破坏的多少，含量越高，氨基酸被破坏的越多，营养价值也随之变低，挥发性盐基氮值是反映动物性食品新鲜程度的指标[32]。由表3可知，加入样品后，菌株挥发性盐基氮值都增加，A，C，D，H菌株的TVB-N值明显增加。

表3 分离菌株的TVB-N值Table 3 TVB-N content of isolated strains

通过菌落总数和TVB-N的测定可知，A，C，D，H菌株对产品的致腐能力更明显，因此将A，C，D，H菌株作为香辣仔鹅的特定腐败菌。

2.2 特定腐败菌的生理生化鉴定结果

表4 生理生化实验结果Table 4 Results of physiological and biochemical experiments

续 表

根据目的菌株的形态和生理生化结果进行初步鉴定，对比《伯杰氏细菌鉴定手册》[33]，A，C，D的菌体为球状，菌落不透明，均为革兰氏阳性细菌，且接触酶阳性，产酸，不产气，不产生吲哚，能将硝酸盐还原，能分解尿素，初步得到A，C，D均为葡萄球菌属的一种。H菌体为杆状，菌落形状不定形，边缘不规则，不透明，且色暗，产酸，不产气，V.P.为阳性，不产生吲哚，接触酶阳性，能水解淀粉、还原硝酸盐，是革兰氏阳性细菌，且能还原石蕊牛奶，初步判定为枯草芽孢杆菌。

2.3 特定腐败菌的分子生物学鉴定结果

菌株A，C，D，H的150 V、100 mA、20 min琼脂糖电泳图见图1。

图1 菌株A，C，D，H的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of strains A,C,D,H

由图2可知，菌株A是腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，菌株C是巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)，菌株D是鸡葡萄球菌(Staphylococcusgallinarum)，菌株H是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

图2 特定腐败菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of specific spoilage bacteria

2.4 小结

菌株A为Staphylococcussaprophyticus，是传统发酵肉制品中普遍存在的一种微生物[34]，Lee等[35]也在韩国高盐发酵海产品jeotgal中发现腐生葡萄球菌。其可引起泌尿生殖道感染、腐生葡萄球菌肺炎等细菌性感染[36,37]。García等[38]在马食中添加魔鬼鱼和腐生葡萄球菌，能有效替代玉米饲料，减少温室气体排放。

菌株C为Staphylococcuspasteuri，其最初是由法国巴斯德研究所发现并命名[39]，其能高效降解甲胺磷[40]，且发酵液中含有D的一种可降解类胡萝卜素的酶[41]，能降低对食品的污染[42]等。Hong Jisoo等[43]研究得出StaphylococcuspasteuriRSP-1能产生巴氏菌素，无细胞上清液对葡萄球菌有很强的抗菌活性。巴氏葡萄球菌TS-82可联合酿酒酵母发酵沙棘果酒催化类胡萝卜素，降解产生风味物质[44]。

菌株D为Staphylococcusgallinarum，其最初由Devriese等人报道[45]，其一般只感染家禽等动物，对人的感染至今罕见报道，只在国外发现一例[46]。在原料为50 g酵母提取物I-1、45 g CaCl2I-1和5 g麦芽糖I-1的培养基中，能通过Staphylococcusgallinarum制备gallidermin[47]，且与最佳供养条件相比，氧供给量下降65%，gallidermin增长50%以上[48]。

菌株H为Bacillussubtilis，是芽孢杆菌属的一种，在植物和土壤的表面普遍存在，是植物体内常见的内生菌，其不污染环境，且对人畜无毒无害[49]。因其具有生理特征多样、耐热、抗逆性强、无致病性、不易产生抗药性、极易分离培养、可产多种抗菌素和酶的特点，应用十分广泛，可应用于食品发酵、防治植物病害、防治畜禽疾病、净化养殖环境等[50]，曾在郫县豆瓣[51]、发酵甜面酱[52]中分离出枯草芽孢杆菌。

3 结论

菌株A是G+菌，在镜检下菌体形状为球状，兼性厌氧，不产芽孢，接触酶阳性，可还原硝酸盐，最适生长温度为30～37 ℃，是腐生葡萄球菌。菌株C是G+菌，在镜检下菌体形状为球状，兼性厌氧，不运动，不产芽孢，接触酶阳性，可还原硝酸盐，最适生长温度为30～37 ℃，是巴氏葡萄球菌。菌株D是G+菌，在镜检下菌体形状为球状，兼性厌氧，不产芽孢，接触酶阳性，可还原硝酸盐，最适生长温度为30～37 ℃，是鸡葡萄球菌。菌株H是G+菌，在镜检下菌体形状为直杆状，接触酶呈阳性，嗜温、产芽孢、好氧，是枯草芽孢杆菌。

腐生葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、鸡葡萄球菌及枯草芽孢杆菌是存在于香辣仔鹅中的特定腐败菌，其中枯草芽孢杆菌的致腐能力略强于巴氏葡萄球，其次为腐生葡萄球菌和鸡葡萄球菌。香辣仔鹅中的腐生葡萄球菌可能来源于人体与产品的接触；巴氏葡萄球菌和鸡葡萄球菌可能来源于鹅肉本身；枯草芽孢杆菌是常见的食品致腐菌，也是冷吃兔的特定腐败菌。在香辣仔鹅的工业化生产中，可以通过优化鹅肉来源、减少人体接触频率、增加灭菌过程、创造无菌包装条件等措施，抑制特定腐败菌的生长，进而延长产品的货架期。