纤维素酶法提取花生壳中木犀草素工艺研究＊

朱 欣，王柯然，唐 功

（阿坝师范学院，资源与环境学院，四川 汶川 623002）

花生壳是一年生草本植物花生的木质外壳[1]，营养物质含量很低，含有大量的纤维素；可药用，但一般不食用；具有止咳化痰、抗菌消炎、降压降脂等功效。花生壳中富含有木犀草素。木犀草素是一种具有抗氧化性的天然黄酮，在植物界分布较为广泛；木犀草素也是一种比较特殊的成分，在人体中不被分解代谢，可发挥出抗氧化、抗过敏、降血压、杀菌消炎等功效[2]。花生壳是花生加工过程中的废弃物，资源丰富，价格低廉，将花生壳作为对木犀草素的研究所用的原料不仅降低成本，还保护了生态环境，具有巨大的经济潜力和重要的实际意义。

目前，从花生壳中提取木犀草素的方法主要有碱处理法、萃取法、超声波提取法、微波法[3]等。木犀草素的含量测定方法有间接原子吸收法、高效液相色谱法、荧光法[3]等。本实验主要采取乙醇回流提取法[4]，其中辅助方法主要为纤维素酶法[5]；回流提取法具有节省溶剂用量、操作简单、提取效率高等优点。运用紫外分光光度计[6]测定其含量，此方法操作简单快速，结果准确可靠。

1 试剂与仪器

纤维素酶：10000U/g（无锡高润杰科技有限公司）

花生壳：花生果产于四川省雅安市，手工剥壳，粉碎 后备用。

柠檬酸、95%乙醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

UV-1800PC型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

JJ324BC型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂

微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）。

HH-S2恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂

SHB-Ⅲ抽滤机，郑州长城科工贸有限公司。

2 实验方法

2.1 提取工艺流程

花生壳→75℃下烘干→粉碎后过60目筛→纤维素酶预处理→抽滤→75%乙醇提取→抽滤→花生壳提取液。

2.2 实验操作步骤

取适量的花生壳干燥粉碎过60目筛；称取1g花生壳粉末，加入适量的PH=5.2的缓冲溶液[5]，再加入0.1%的纤维素酶在恒温水浴锅50℃下进行酶解，抽滤得到经过预处理的花生壳粉末，使用75%的乙醇[7]在提取温度为85℃下回流提取，抽滤得到提取液。

2.3 木犀草素含量的测定

取1mL的提取液，加入2mL、0.1mol/L的AlCl3溶液，混匀，再加入3.2mL、1mol/L的CH3COOK溶液[7]，使其充分混匀，静置15min。以蒸馏水作为空白对照，用紫外分光光度计在408nm[7]处测定吸光值。

3 结果与分析

3.1 料液比对提取结果的影响

固定酶用量0.1%、酶解时间1.5h、酶解温度50℃、回流时间1.5h的条件下，观察不同料液比对花生壳中木犀草素提取的影响，结果如图1所示。

图1 不同料液比下花生壳提取液中木犀草素的吸光度

由图1可得，料液比越大，其吸光度越大，由此可见料液比对木犀草素的提取影响较为明显。但在一定值时其含量达到了峰值，料液比1∶8（g/mL）时吸光度最大，再1∶8之后时吸光度就开始降低，由于随着溶剂倍数的增加，溶剂与物料之间接触更加紧密[8]，但过量加入溶剂时，稀释了其浓度。因此，提取时料液比最佳为1∶8。

3.2 酶用量对提取结果的影响

固定料液比1∶8、酶解时间1.5h、酶解温度50℃、回流时间1.5h的条件下，观察不同酶用量对花生壳中木犀草素提取的影响，结果如图2所示。

图2 不同酶用量下花生壳提取液中木犀草素的吸光度

由图2可知，纤维素酶的用量不宜过低，在其酶用量为0.1%时，吸光度达到峰值，增加纤维素酶的用量后，木犀草素的吸光度却在不定量的降低；酶的作用条件微量高效，增加用量反而得不到很好的效果。因此，在提取过程中酶用量为1∶8时最佳。

3.3 酶解时间对提取结果的影响

固定料液比1∶8、酶用量0.1%、酶解温度50℃、回流时间1.5h的条件下，考察不同酶解时间对花生壳中木犀草素提取的影响，结果如图3所示。

图3 不同酶解时间下花生壳提取液中木犀草素的吸光度

由图3可知，木犀草素的吸光度随着酶解时间的增加而增加，但酶解时间超过1.5h后，木犀草素的吸光度随之降低。由于酶解时间在1.5h时纤维素酶的活性得到充分的利用。因此，提取过程中酶解时间最佳为1.5h。

3.4 酶解温度对提取结果的影响

固定料液比1∶8、酶用量0.1%、酶解时间1.5h、回流时间1.5h的条件下，考察不同酶解温度对花生壳中木犀草素提取的影响。结果如图4所示。

图4 不同酶解温度下花生壳提取液中木犀草素的吸光度

由图4可知，酶解温度对木犀草素提取的影响较为明显，木犀草素的吸光度随着温度的增加而增加，但在50℃下达到最大值，50℃后的吸光度明显降低。这一原因是由于酶的特性，酶的作用条件较温和，50℃是酶作用的最佳温度，若再增加其酶解温度可能会使得部分酶失活[8]。因此，提取过程中酶解温度最佳为50℃。

3.5 回流时间对提取结果的影响

固定料液比1:8、酶用量0.1%、酶解时间1.5h、酶解温度50℃的条件下，考察不同回流时间对花生壳中木犀草素提取的影响。结果如图5所示。

图5 不同回流时间下花生壳提取液中木犀草素的吸光度

由图5可知，用75%的乙醇溶液在85℃下提取，使用85℃是由于高温可使得物料中的纤维素酶失活[9]。回流提取的时间在1.5h时为最大值，其后增加其回流提取时间下，木犀草素的吸光度随之降低。这一原因是由于回流时间过长时，乙醇溶液易挥发，大量挥发后使得提取液中部分木犀草素随着乙醇的挥发而挥发[11]。因此，提取过程中回流时间最佳为1.5h。

4 结论

花生壳中木犀草素单因素[11]提取可知：不同提取条件对其提取率的影响较为明显。为了保证其最佳最高的提取结果，最佳的提取条件为料液比1:8、酶用量0.1%、酶解时间1.5h、酶解温度50℃、回流时间1.5h。通过文献可知，经过纤维素酶预处理的后的提取率明显高于乙醇直接提取的方法[9-10]。在实验过程中还应该注意加入酶的顺序，因先调节好缓冲溶液的PH后再加入纤维素酶，避免部分酶失活，从而影响花生壳中木犀草素的提取含量。