Na2CO3 胁迫对山柿幼苗生长和生理特性的影响

殷梦竹，颜玉娟，颜立红

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.湖南省森林植物园，湖南 长沙 410116）

土壤盐碱化是影响植物自然分布、生长发育、降低作物产量和影响农业生产力的生态问题之一[1-3]，严重制约了我国农林业的发展[4]，其中，NaCl，Na2CO3，NaHCO3和Na2SO4是盐碱土中最常见的盐形态[5]。碱性盐胁迫往往在盐度升高的同时伴随着pH升高，因此土壤中含有HCO3-和CO32-等阴离子的情况下，植物在受到盐胁迫的同时还会受到高pH胁迫，通常情况下这种胁迫比单一的盐胁迫对植物体的伤害更加严重[6-7]。探究植物耐盐碱胁迫的生理机制并筛选耐盐碱树种对经济生产显得格外重要。

山柿Diospyros japonica在我国东南沿海盐土区有一定分布，主要分布于浙江、江苏、福建、江西、安徽等省，对土壤适应性强，作为经济林树种在我国西北地区也有一定范围的栽培[8]。山柿在林业生产上具有很大的应用价值，常用作柿树砧木[9]，或用作提炼柿漆的药用植物[10]，或用作优良的速生用材树种。山柿树形优美，秋季叶色红艳，果实橙红，拥有很高的观赏价值，是一种尚未大规模投入应用的园林绿化潜力树种。研究山柿的耐盐碱性具有重要的生产意义和经济价值，本实验采用Na2CO3模拟盐碱胁迫环境，测定其各项生理生化指标并定量分析山柿的耐盐碱性，为山柿的推广应用做好前期准备。

1 材料及方法

1.1 试验材料

试验所用材料来源于湖南省森林植物园苗圃2年生山柿地栽实生幼苗。于2019年4月27日，挑选大小相近、外表无损伤、健康的带土球山柿实生幼苗60株，定植于同一规格（上口径25 cm，高25 cm）的塑料花盆中，配备漏水盘。每盆基质质量3 kg，缓苗2个星期。培养基质采用混合基质，泥炭土∶珍珠岩∶蛭石∶园土体积比为3∶1∶1∶1。供试幼苗置于湖南省植物园温室内。

于苗圃中取样并观测实验过程中的山柿的形态指标，在湖南省森林植物园实验室进行生理生化指标测定。

1.2 试验方法

Na2CO3胁迫试验开始时间为2019年5月14日，为确保试验的准确性，于2019年5月11日开始控水。将60株山柿幼苗随机分成6组，每组10株。1组为蒸馏水处理，作为对照组（CK），其余5组分别用1 g·L-1（A1），2 g·L-1（A2），4 g·L-1（A3），6 g·L-1（A4）和8 g·L-1（A5）Na2CO3溶液以相同的方式浇灌处理，共5个浓度梯度。CK和5个胁迫处理组各10株幼苗。每盆幼苗各浇灌2 L相应浓度的盐溶液。在胁迫处理第8天、第16天、第24天和第32天时再次补充各处理组植株的盐分，每株幼苗各浇灌2 L相应浓度的Na2CO3溶液，在每次相应浓度Na2CO3溶液处理当日浇灌前采样。共4个周期，每次采样时间为8:30，随机选取各处理组中5株幼苗进行采样，即每个梯度各5组重复。在树冠外围各个朝向均匀取样，取其同一层面二级分枝上长势基本一致的成熟叶片3～ 4片，迅速带回实验室，用封口保鲜袋置于不透光的4℃低温箱中保存备用，以进行各项指标的测定。

试验期间为消除生长的边际效应，每15 d轮换一次盆钵摆放位置。观测和记录整个试验期间温室内的温度和湿度，温室内温度最低17℃，最高33℃，湿度保持在60%～ 80%。

1.3 测定的指标及方法

1.3.1 生长指标测定 因各处理周期内山柿幼苗生长量的变化不大，因此，于胁迫0 d和胁迫32 d时，记录所有植株的地径和株高，用卷尺测量株高，单位为cm；用电子游标卡尺测量植株地径（距植株地面以上20 cm处），单位为mm。分别以胁迫32 d时的株高、地径减去胁迫0 d时的株高、地径，得到的差值即为整个试验期间的株高增长量和地径增长量。

1.3.2 生理生化指标测定 本实验选择了叶片相对含水量（relative water content，RWC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量、可溶性糖（soluble sugar，SS）含量、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性作为研究的生理指标。测定RWC采用烘干称量法[11]；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[12]；SP含量采用考马斯亮蓝G-250法[13]；SS含量采用蒽酮比色法[14]；POD酶活性采用愈创木酚氧化法[15]，以每分钟内OD470变化0.01的酶量定义为1个活力单位(U）；SOD酶活性采用氮蓝四唑光化还原法[15]，以抑制氮蓝四唑光化学反应的50%为一个酶活性单位（U）。

1.4 数据处理与分析

采用Excel软件进行数据计算和整理，并用SPSS 23软件进行方差分析以及Duncan多重比较，分析时以P＜0.05作为显著性差异，利用Origin 8进行作图。

2 结果与分析

2.1 Na2CO3 胁迫对山柿株高和地径增长量的影响

由表1表明，Na2CO3胁迫处理32 d时，以A2的株高增长量最高，显著高于CK（P＜0.05），而A5的株高增长量则最低，显著低于CK（P＜0.05），且A2与A5处理间也呈显著差异（P＜0.05）。处理32 d时，A3的地径增长量显著高于CK处理（P＜0.05），A4的地径增长量显著低于CK（P＜0.05），并且A3与A4处理间也呈显著差异（P＜0.05）。Na2CO3胁迫32 d时，株高和地径增长量随着胁迫浓度的上升均呈先上升后下降的趋势。

表1 Na2CO3胁迫32 d时山柿幼苗的株高和地径增长量Table 1 Height and ground diameter growth of D.japonica seedlings 32 days after Na2CO3 stress

2.2 Na2CO3 胁迫对山柿叶片RWC 的影响

由图1可知，Na2CO3胁迫处理8 d时，仅A3的RWC有所下降，显著低于CK和其他处理（P＜0.05）；胁迫16 d时，A2，A3和A4的RWC显著高于CK（P＜0.05）；胁迫24 d时，A1和A2的RWC显著高于CK（P＜0.05），A3，A4和A5的RWC均低于CK处理，但与CK之间均未达显著差异水平，各处理的RWC均随着胁迫浓度的上升呈下降趋势。胁迫32 d时，各处理的RWC均显著低于CK（P＜0.05），其中A1同时显著低于其他4个浓度的胁迫处理。各处理的RWC随着胁迫时间的增加整体呈下降趋势。

2.3 Na2CO3 胁迫对山柿叶片MDA含量的影响

由图2可知，Na2CO3胁迫处理8 d时，A2，A3，A4和A5的MDA含量均低于CK，其中A4和A5显著低于CK（P＜0.05）。胁迫16 d时，各处理的MDA含量均显著低于CK（P＜0.05）。胁迫24 d时，A1的MDA含量显著低于CK（P＜0.05），而A2，A3，A4和A5的MDA含量则显著高于CK（P＜0.05），各实验组的MDA含量随着胁迫浓度的上升均呈上升趋势，且所有处理间均差异显著（P＜0.05）。胁迫32 d时，所有处理的MDA含量均显著高于CK（P＜0.05），且所有处理间的差异均达显著水平（P＜0.05）。随着处理时间的增加，各处理的MDA含量整体呈上升的趋势。

图1 Na2CO3 胁迫不同时间对山柿叶片 RWC 的影响Figure 1 Effect of Na2CO3 stress on relative water content in D.japonica leavesD.japonica leaves

2.4 Na2CO3 胁迫对山柿叶片SP含量的影响

由图3可知，Na2CO3胁迫8 d时各处理的SP含量与CK之间均无显著差异，但A3的SP含量高于其他各处理。胁迫16 d时，各处理的SP含量均显著高于CK（P＜0.05），各处理间除A3与A4间差异不显著，其他处理之间差异均达显著水平（P＜0.05），且各处理的SP含量随着胁迫浓度的上升均呈上升趋势。胁迫24 d时，A2，A3，A4和A5的SP含量显著高于CK（P＜0.05）；A1与CK间则无显著性差异。胁迫32 d时，各处理的SP含量均显著高于CK（P＜0.05），其中A4和A5的SP含量显著高于A1，A2和A3。各处理的SP含量随处理时间的增加总体呈上升趋势，其中胁迫16 d时CK的SP含量明显低于胁迫8，24和32 d时CK处理的SP含量。根据天气记录以及温度记录发现，胁迫16 d时棚内气温为22℃左右，最低气温可达17℃，而胁迫8，24和32 d时气温均达到32～ 33℃，因此推测胁迫16 d时CK的SP含量降低可能与温度低有关，各胁迫处理由于受到胁迫影响因而没有CK明显。推测这一现象是由于山柿叶片SP含量对温度变化较敏感所致。

图2 Na2CO3 胁迫对山柿叶片MDA含量的影响Figure 2 Effect of Na2CO3 stress on the content of MDA in D.japonica leaves

图3 Na2CO3 胁迫对山柿叶片SP含量的影响Figure 3 Effect of Na2CO3 stress on the content of SP in D.japonica leaves

2.5 Na2CO3 胁迫对山柿叶片SS含量的影响

由图4可知，Na2CO3胁迫8 d时，A3和A4的SS含量显著高于CK（P＜0.05），A5则显著低于CK（P＜0.05）。胁迫16 d时，各处理的SS含量均显著高于CK（P＜0.05），其中A4的SS含量上升幅度最大。胁迫24 d时，A1的SS含量显著低于CK（P＜0.05）；A2，A3，A4和A5的SS含量均显著高于CK（P＜0.05）。胁迫32 d时，各处理的SS含量均显著高于CK（P＜0.05）。各处理的SS含量随着处理时间的增加大致呈先上升后下降的趋势。

2.6 Na2CO3 胁迫对山柿叶片POD酶活性的影响

由图5可知，Na2CO3胁迫8 d时，A1的POD酶活性显著高于CK和其他胁迫处理（P＜0.05），除A1外，其他处理间差异均不显著。胁迫16 d时，A2，A3，A4和A5的POD酶活性显著高于CK（P＜0.05），其中以A3的上升幅度最大，各胁迫处理的POD酶活性随着胁迫浓度的上升呈先上升后下降的趋势。胁迫24 d时，A4和A5的POD酶活性显著高于CK（P＜0.05），但两者间没有显著差异；A1，A2和A3则与CK间没有显著性差异。胁迫32 d时，A4的POD酶活性显著高于CK（P＜0.05），其他处理则与CK间没有显著性差异。各处理的POD酶活性随处理时间的增加大致呈先上升后下降的趋势。

2.7 Na2CO3 胁迫对山柿叶片SOD酶活性的影响

由图6可知，Na2CO3胁迫8 d时，A1和A2的SOD酶活性显著高于CK（P＜0.05），而A3，A4和A5的SOD酶活性则显著低于CK（P＜0.05）。Na2CO3胁迫16 d时，A1和A2的SOD酶活性显著高于CK（P＜0.05），A3，A4和A5的SOD酶活性显著低于CK。胁迫24 d时，A2，A4和A5的SOD酶活性显著高于CK（P＜0.05），其中A4和A5的SOD酶活性显著高于A2（P＜0.05）。胁迫32 d时，A3和A4的SOD酶活性显著高于CK，A1，A2和A5的SOD酶活性则与CK间无显著性差异。

图4 Na2CO3 胁迫对山柿叶片SS含量的影响Figure 4 Effect of Na2CO3 stress on the content of SS in D.japonica leaves

图5 Na2CO3 胁迫对山柿叶片POD酶活性的影响Figure 5 Effect of Na2CO3 stress on the activity of POD in D.japonica leaves

图6 Na2CO3 胁迫对山柿叶片SOD酶活性的影响Figure 6 Effect of Na2CO3 stress on the activity of SOD in D.japonica leaves

2.8 Na2CO3 胁迫对山柿生长表型的影响

实验观测发现，山柿在为期32 d的1～ 8 g·L-1Na2CO3胁迫下，在表型上没有受到明显的影响。胁迫32 d时，A4处理10株幼苗中有1株叶片脱落情况较明显，几乎全部脱落；A510株幼苗中有2株叶片几乎全部脱落，但均不能认定为彻底死亡。A1，A2和A3的叶片有一定程度的卷曲、发黄和脱落现象，但没有很严重的大面积枯黄萎蔫，亦没有很严重的脱落。

3 讨论与结论

3.1 讨论

盐碱胁迫对植物的正常生长发育最明显也是最直观的效应就是抑制生长，其正常生长速率会受到一定影响，通常情况下表现为植株矮小、生长缓慢、产量降低等[16]。本研究结果发现，所有Na2CO3胁迫处理的山柿株高、地径均有所增长，但随着Na2CO3浓度的上升其增长量也受到一定抑制。2 g·L-1Na2CO3胁迫对山柿的株高增长量有一定的促进作用，而8 g·L-1Na2CO3胁迫则对山柿植株造成了较大的伤害，抑制其株高生长速率。4 g·L-1Na2CO3胁迫对山柿地径的生长速率有一定的促进作用，但6 g·L-1Na2CO3胁迫对其地径生长速率则有抑制作用。本实验结果与梁芳[17]等对玉蕊Barringtonia racemosa盐胁迫下株高和地径的变化测定结果基本一致。综合分析可发现，在为期32 d的Na2CO3胁迫下，各浓度处理下的山柿植株在生长指标上表现为具有一定的抗盐性，但较高浓度下（6～ 8 g·L-1）其生长速率仍会受到一定的抑制。

相对含水量是植物组织实际含水量占其饱和含水量的百分比，是表示植物组织水分状况的一个常用指标[18]。一般来说，植物相对含水量变化越大，其耐盐碱性相对越弱[19]。Na2CO3胁迫24 d时，1～ 2 g·L-1胁迫处理的山柿叶片吸水能力有所上升；但4～ 8 g·L-1Na2CO3胁迫导致山柿细胞失水严重，其相对含水量显著下降。胁迫32 d时，各胁迫处理叶片均失水严重。较低浓度胁迫下植物体受到的伤害较小，相对含水量变化不大；而随着胁迫时间的延长和胁迫浓度的上升，各胁迫处理的叶片吸水保水能力整体有所下降，遭受较严重的生理干旱，这与杨庆山[20]等对碱胁迫下柽柳Tamarix chinensis叶片相对含水量变化的分析结果基本吻合。

植物体内的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等，它们主要通过清除体内的活性氧来保护植物体，其活性往往能够反应植物体的代谢和抗逆性的变化。通常情况下，保护酶的活性越高，植物对逆境胁迫的适应能力越强。本实验结果显示，Na2CO3胁迫16 d时山柿能够一定程度上提升POD酶活性；胁迫24 d时，6 g·L-1和8 g·L-1处理组POD酶活性有显著提升，胁迫32 d时则只有6 g·L-1处理组的POD酶活性显著升高以减轻氧化损伤，这与李莹莹[21]等对猴樟Cinnamomum bodinieri幼苗在盐碱胁迫下POD酶活性的研究结果基本一致。这说明在长期胁迫处理下，山柿能够在一定程度上提升POD酶活性以减轻胁迫对植物细胞带来的伤害。Na2CO3胁迫24 d时山柿能够提升SOD酶活性抵抗细胞毒害；胁迫32 d时2～ 6 g·L-1胁迫组仍具有较高的抗氧化能力，但8 g·L-1处理组受到的伤害较大因而这种调节能力不明显，该实验结果与董静[22]等对盐碱胁迫下马齿苋Portula caoleracea幼苗的SOD酶活性研究结果有相似之处。山柿POD酶和SOD酶活性能够共同上升以对抗氧化损伤。

MDA是一种膜脂过氧化产物，具有很强的细胞毒害性，能够破坏植物细胞中的蛋白质、核酸等有机分子，对细胞膜产生很大的损伤。其含量高低一定程度上能够反映细胞膜脂受伤害的程度[23-24]。本实验结果显示，Na2CO3胁迫8～ 16 d时山柿叶片细胞受到的膜脂过氧化伤害较轻，甚至存在含量有所下降的现象，导致该结果的原因可能与抗氧化酶活性有关。结合抗氧化酶的活性进行分析，在胁迫16 d时各胁迫处理的POD酶活性显著上升，其MDA含量的下降可能与该现象有一定的关联；而胁迫24～ 32 d时，叶片中的MDA含量随着浓度的上升明显增加，叶片受到的毒害作用也就越严重，该现象与景宇鹏[25]等对玉蜀黍Zea mays在Na2CO3胁迫下MDA含量的变化的测定结果基本吻合。

有一定耐盐碱能力的植物，通常可以通过自我调节内环境来对抗盐碱胁迫引起的渗透胁迫与离子毒害[26]，例如通过积累无机离子、合成有机小分子物质来维持自身细胞渗透势，从而保证正常的生命活动[27]。整个Na2CO3胁迫试验期间山柿的SP含量大致呈上升趋势。在32 d的Na2CO3胁迫下，山柿能够大量积累SP以维持自身渗透压，且随着胁迫时间的延长和胁迫浓度的上升明显上升，尤其是胁迫32 d时，各实验组的SP含量上升幅度非常大，该结果与王志强[28]等对盐碱胁迫下酸枣Ziziphus jujuba幼苗叶片中SP含量的测定结果基本一致。整个实验期间各处理组的SS含量均有一定程度的上升以维持细胞膨压，且在胁迫24 d时总体积累的量最多，6 g·L-1胁迫组上升的幅度总是比较高。这与李雅男[29]等对‘索邦’百合‘Sorbonne’在碱性盐胁迫下SS含量的研究结果有相似之处。该实验结果表明，在SS这项指标的表现上，6 g·L-1的胁迫处理组适应能力最强，其SS积累的量总是最高的，能够较好地维持细胞渗透压。在Na2CO3胁迫下山柿能够大量积累SP和SS以维持自身渗透压，渗透调节是山柿抵抗Na2CO3胁迫的重要方式之一。

3.2 结论

较高浓度（6 g·L-1和8 g·L-1）Na2CO3胁迫对山柿株高和地径的生长速率有一定的抑制作用，而较低浓度（2 g·L-1和4 g·L-1）胁迫则有一定的促进作用。在短期胁迫（胁迫0～ 24 d时）下，叶片失水情况较轻，在长期胁迫（胁迫32 d时）下，各胁迫处理的叶片失水严重；胁迫24～ 32 d时，山柿叶片细胞积累大量MDA，细胞受到较严重的氧化损伤，POD酶和SOD酶活性都有明显上升以清除过量活性氧，对抗胁迫环境；各胁迫处理的山柿均能够大量积累SS和SP以维持自身细胞渗透势。本研究结果表明，山柿对1～ 4 g·L-1的Na2CO3胁迫具有一定的适应性并促进其生长，在6 g·L-1和8 g·L-1Na2CO3胁迫下，虽依然具备一定的自我调节能力，能够调整各项生理指标以应对胁迫环境，但仍会受到一定程度的破坏与损伤。经过胁迫试验发现，山柿能够耐受1～ 8 g·L-1Na2CO3胁迫而未出现死亡，这说明山柿对碱性盐胁迫忍耐程度较强，较适宜在我国东南沿海盐碱地面积较大的区域种植。山柿的自然生长环境以山地为主，我国东南沿海盐碱地多为围垦后形成的地势平坦区域，多伴有积水、板结等问题，故在推广应用中应该首选海岛地区。而向温度、水分条件较差的北方区域推广时，需结合抗旱性和抗寒性等方面的研究结果综合考虑。由于目前有关山柿其他抗性定量研究的缺失，因此有关其耐旱性、耐寒性、耐高温、耐水湿和抗重金属胁迫等方面的定量研究还有待进一步进行。