HPLC法快速检测黑糯米酒中有机酸含量

王洪琳，苏 伟，母应春，姜 丽，赵 驰

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

酸是酒中重要的呈味物质，有机酸在酒的口感和风味中起着关键作用[1]，其含量直接影响黑糯米酒的口感[2]，含量过低，导致酒体平淡无味，过高则使酒体生硬粗涩，是酒中酸味的主要承担者，与其他呈味化合物共同组成酒特有的芳香，具有一定的呈香、呈味作用。此外，有机酸还可以溶解酒中色素，使酒的颜色更加纯净美观[3]，且适量的有机酸能抑制细菌的生长，降低黑糯米酒的甜度，增强黑糯米酒的浓香，还能在贮藏过程中促进酯类物质形成[4]。由于酿造工艺和酿造原料的不同，使得黑糯米酒中主要有机酸种类和含量有一定的差异。因此，对黑糯米酒中主要有机酸进行测定，明确黑糯米酒中有机酸种类和含量对调整黑糯米酒的口味和提高酒的质量尤为重要[5-6]。

目前有机酸的测定常采用气相色谱法（gas chromatography，GC）[7]、酸碱滴定法[8]、离子色谱（ion chromatography，IC）法[9-11]、红外光谱（infrared spectrum，IRS）法[12]和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13]等。其中HPLC法准确度高、样品前处理简单、重现性好，且操作简单，可同时测定多种有机酸，已得到广泛应用[14]。但在实际检测中，由于使用仪器和色谱柱型号的差异，测定方法和色谱条件也有所相同。本试验在前人研究的基础上，对黑糯米酒中有机酸含量的测定方法进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

11种黑糯米酒（依次编号为HMJ1～HMJ11，HMJ1福建龙岩；HMJ2、HMJ3广东梅州；HMJ4、HMJ5广东河源；HMJ6、HMJ7陕西洋县；HMJ8贵州清镇；HMJ9、HMJ10、HMJ11贵州惠水）：市售。磷酸二氢钠、酒石酸（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、乳酸、草酸、柠檬酸、磷酸（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；丙酮酸、L-苹果酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、琥珀酸（均为分析纯）：麦克林生化科技有限公司；甲醇（色谱纯）：河北百灵威超精细材料有限公司。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260高效液相色谱仪（配置G1329B自动进样器、G1311C四元低压泵、G1316A柱温箱、G1315D二极管阵列检测器，ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

样品处理：同时将样品未处理、活性炭处理和离心处理，过0.22 μm滤膜后上机发现测试结果差异不显著，故不对样品进行处理，直接取样过0.22 μm水系滤膜后待上机。

有机酸混标的配制：分别称取草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、焦谷氨酸、苹果酸各0.050 g，酒石酸、琥珀酸各0.10 g，乳酸0.42 g，乙酸1.05 g，用蒸馏水溶解后于100 mL容量瓶定容至刻度，制成母液待用。

1.3.2 色谱条件的优化

取有机酸混标母液10 mL定容至50 mL容量瓶，在200～400 nm范围内对其进行扫描，发现在波长210 nm处各有机酸峰形及吸收峰最佳，故测定波长确定为210 nm。

（1）流动相磷酸盐的选择

多数缓冲液在波长210 nm附近有较强的吸收，磷酸盐缓冲液是最典型、最适合的缓冲液，其在紫外区几乎无吸收，可以提高检测的灵敏度，因此选择磷酸盐作为有机酸分析的流动相。分别配制0.02 mol/L的磷酸二氢钾、磷酸二氢钠及磷酸氢二铵溶液，调节pH值为2.90；进样量：10 μL；检测器：G1315D；ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱温：35 ℃；流速：0.00～4.00 min，流速为1.0 mL/min；4.00～10.00min为0.30mL/min；10.00min后流速为1.0mL/min；检测波长：210 nm。

（2）流动相浓度的选择

缓冲液浓度的高低影响溶液的离子强度及有机酸在流动相中的存在形式，从而影响色谱柱对有机酸的分离效果，其浓度越高，待测有机酸的存在形式越稳定。但其浓度又不宜过高，浓度升高会增大离子强度，对组分分离不利，同时还影响柱子和泵的使用寿命，从而降低检测灵敏度。所以配制磷酸二氢钠溶液的浓度为0.01 mol/L、0.02 mol/L和0.03 mol/L，调节pH值为2.90，其他条件不变，探讨不同浓度磷酸二氢钠作为流动相对各有机酸保留时间及分离效果的影响。

（3）流动相pH值的选择

因有机酸属于弱酸，在溶液中的解离程度受溶液pH控制，提高缓冲液H+浓度，有机酸解离平衡则倾向分子态，从而增加有机酸在色谱柱上的保留，各有机酸因其分配系数不同而被分离。故配制pH值为2.50、2.70、2.90和3.10，浓度为0.03mol/L的磷酸二氢钠溶液。其他条件不变，分析不同pH的磷酸二氢钠溶液对各有机酸保留时间及分离效果的影响。

（4）柱温的选择

流动相的黏度和传质效率受色谱柱柱温影响，柱温升高，流动相的黏度下降，传质效率提高，使得待测物质保留时间缩短，但柱温过高不利于组分的分离且影响色谱柱使用寿命。因此选择柱温为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，浓度为0.03 mol/L的磷酸二氢钠溶液为流动相，pH值2.90，其他条件不变，分析不同柱温对10种有机酸分离效果的影响。

（5）流动相中甲醇的比例

流动相中甲醇的加入不仅能改善色谱峰形，还能缩短分析检测时间，故选择流动相甲醇-磷酸二氢钠的比例为0∶100、1∶99、3∶97、5∶95（V/V），探讨流动相中甲醇加入的不同比例对有机酸分离效果的影响。

1.3.3 黑糯米酒中10种有机酸的测定

（1）标准曲线的制作

取有机酸混标母液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于50 mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度，过0.22 μm滤膜待用。每个浓度做3个平行，以各种有机酸的浓度为自变量，色谱峰的平均峰面积为因变量，外标法定量。

色谱条件：流动相为0.03 mol/L磷酸二氢钠溶液，不加甲醇，pH2.90；进样量10 μL；检测器为G1315D；ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱温35 ℃；流速：0～4 min，流速为1.0 mL/min；4～10 min为0.30 mL/min；10 min后流速为1.0 mL/min。检测波长：210 nm。

（2）黑糯米酒中10种有机酸含量的测定

直接取酒样过0.22 μm水系膜后，按1.3.3中（1）的色谱条件进行测定。

1.3.4 方法性能评价

（1）重复性实验

按照1.3.3中（1）的色谱条件，取HMJ1样品1.5 mL过0.22 μm滤膜后，对有机酸的峰面积进行6次测定，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）精密度实验

按照1.3.3中（1）的色谱条件，取1.3.2中有机酸母液1.5 mL过0.22 μm滤膜，连续进样6次，测定10种有机酸的峰面积，计算相对标准偏差。

（3）加标回收率试验

按照1.3.3中（1）的色谱条件，将HMJ1样品与1.3.2中有机酸混标按1∶1（V/V）混合后取1.5 mL过0.22 μm过滤膜后上机。同时做样品对照。对10种有机酸进行加标回收率实验。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 磷酸盐的选择

不同磷酸盐对10种有机酸标准液保留时间及分离效果的影响如图1所示。

图1 流动相磷酸盐种类对10种有机酸分离效果的影响Fig.1 Effect of phosphate types in mobile phase on the separation of 10 organic acids

由图1可知，以磷酸二氢钠作为流动相时，10种有机酸都得到了很好的分离，对有机酸检测得干扰小。对比图谱可知，当用磷酸二氢钾和磷酸氢二铵作流动相时，各有机酸出峰顺序一致，但柠檬酸和乙酸之间的分离效果差，且杂峰对琥珀酸的影响较大。因此，本研究选择使用磷酸二氢钠作流动相。

2.1.2 流动相中磷酸盐浓度的选择

磷酸盐浓度的不同，各有机酸的分离度也不同，不同浓度磷酸二氢钠溶液对10种有机酸分离效果的影响结果如图2所示。

图2 流动相磷酸二氢钠浓度对10种有机酸分离效果的影响Fig.2 Effect of sodium dihydrogen phosphate concentration in mobile phase on the separation of 10 organic acids

由图2可知，磷酸二氢钠的浓度对于10种有机酸的峰形及分离效果均具有一定的影响，对比3个不同磷酸二氢钠浓度的色谱图可知，当磷酸二氢钠溶液得浓度升高时，10种有机酸的保留时间有所缩短，且10种有机酸的分离效果和峰形越来越好，当磷酸二氢钠的浓度为0.03 mol/L时，草酸峰形的后拖尾有所改善。因此，本研究选择0.03 mol/L的磷酸二氢钠溶液作为流动相。

2.1.3 流动相pH的选择

不同pH的磷酸二氢钠流动相对10种有机酸保留时间及分离效果的影响如图3所示。

由图3可知，不同pH的流动相对10种有机酸的分离效果、出峰时间和峰形均存在较大影响，对比不同pH的色谱图可知，随着流动相中H+浓度的降低，10种有机酸的保留时间均有较大的缩短，特别是焦谷氨酸的出峰时间由8.86 min提前至7.49 min；同时，pH对柠檬酸和乙酸的出峰时间影响也较大，当pH为2.50时，柠檬酸出峰时间在乙酸后，当pH为2.70时，柠檬酸与乙酸出峰时间重合，难以分离，当pH为2.90，柠檬酸在乙酸前出峰，两者的之间分离度较好，当pH继续升高至3.10时，柠檬酸与乳酸出峰时间接近，分离度差，且色谱峰出现一定程度的拖尾现象。故本研究选择磷酸二氢钠溶液的pH为2.90。

图3 流动相pH值对10种有机酸分离效果的影响Fig.3 Effect of pH value of mobile phase on the separation of10 organic acids

2.1.4 柱温的选择

不同柱温对10种有机酸保留时间及分离效果的影响如图4所示。

图4 柱温对10种有机酸分离效果的影响Fig.4 Effect of column temperature on the separation of 10 organic acids

由图4可知，柱温的改变对10种有机酸分离效果的影响较大，当柱温为25 ℃和30 ℃时，乙酸与柠檬酸出峰时间重合，难以分开，同时乳酸与α-酮戊二酸的分离度和峰形较差。但随着温度的升高，10种有机酸均得到有效分离，当温度为35 ℃时，10种有机酸的分离度和峰形最佳，且噪音低。当温度继续升高至40 ℃时，10种有机酸的分离度不受影响，但峰形出现一定程度的拖尾，其中琥珀酸的拖尾较严重，且温度升高时，色谱柱损伤亦随之增大。故本试验选择的柱温为35 ℃。

2.1.5 流动相中有机相比例的选择

调节甲醇和磷酸二氢钠溶液的体积比分别为0∶100、1∶99、3∶97和5∶95（V∶V），其对10种有机酸保留时间及分离效果的影响如图5所示。

有机相的加入不仅可以改善峰形，且对色谱柱有一定程度的保护作用，能降低流动相的极性，缩短分析检测的时间，由图5可知，甲醇的加入对10种有机酸分离效果和保留时间的影响较大，随着甲醇的加入，10种有机酸保留时间随之提前，其分离度也受影响。当加入3%、5%的甲醇时，苹果酸与α-酮戊二酸、柠檬酸与乙酸不能达到相应的分离效果，与不添加甲醇相比，峰形和噪音改善不明显。且达不到相应的分离效果，本实验的色谱柱可耐受纯水相，故使用100%无机相作为流动相不会导致色谱柱填料塌陷，且10种有机酸均能在10 min以内达到基线分离，故本实验不加甲醇。

图5 流动相中甲醇比例对10种有机酸分离效果的影响Fig.5 Effect of methanol percentage in mobile phase on the separation of 10 organic acids

2.2 黑糯酒中10种有机酸含量的测定

2.2.1 标准曲线回归方程

分别以10种有机酸的浓度为自变量（x），峰面积（y）为因变量进行标准曲线回归方程的计算，结果见表1。

表1 10种有机酸回归方程Table 1 Regression equations of 10 organic acids

由表1可知，10种有机酸的线性回归方程的相关系数（R2）均大于0.999 0，由此可知10种有机酸在浓度范围内具有良好的线性关系，且检出限在0.014 9～0.219 0 mg/L之间，具有较高的灵敏度，可以满足黑糯米酒中有机酸测定要求。

2.2.2 黑糯米酒中有机酸含量测定

按1.3.3中（1）的色谱条件对11个黑糯米酒样品中10种有机酸测定的结果如表2所示。

由表2可知，乳酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸和柠檬酸是主要的有机酸，这与CAO Y等[15]对黄酒中有机酸的研究结果相符。11个酒样中只有HMJ6检出全部10种有机酸，其余样品中只检测出部分有机酸，且含量各异，这可能与样品的原料、工艺等有关。除样品HMJ3没有检测出乳酸外，其余样品均检测出乳酸，除HMJ1、HMJ3外，乳酸含量是每个样品中含量最高的，而HMJ3中含量最高的有机酸则是酒石酸。仅在HMJ1和HMJ6中检测到琥珀酸，且HMJ1含量较高，琥珀酸能够使酒体更加醇厚。黑糯米酒中的有机酸主要是由发酵过程中存在的酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌等多种微生物通过三羧酸或丙酮酸循环代谢形成。乳酸等有机酸的存在能够缓解发酵黑糯米酒中乙酸带来的强烈刺激性，从而赋予黑糯米酒酸味柔和，回味绵长的口感特点。乳酸比较柔和，能给黑糯米酒带来良好的风味，其香气虽然微弱，但由于含量较高，对黑糯米酒起到增加醇厚感的作用。同时，在异常情况下，当发酵醪液中的乳酸杆菌和外界侵入的有害菌大量生长繁殖，产生过量的乳酸，致使发酵醪液的酸度上升，抑制正常酵母发酵产酒精，当总酸度＞7.5 g/L时，发酵醪液的香味和口味就变坏，称为酸败，因此，乳酸含量对黑糯米酒的品质起着关键作用，是生产过程中需要控制的一个重要指标。

本实验对11种黑糯米酒样品中的有机酸进行主成分分析（principal component analysis，PCA），计算各个因子得分，对样品进行综合评价，结果如图6所示。从图6可以看出，11个样品在第一主成分和第二主成分上勉强区分开，可以被分为4个区域。福建龙岩黑糯米（HMJ1）酒位于图中PC1负方向区域；广东梅州黑糯米酒和陕西黑米酒（HMJ2、HMJ3、HMJ6、HMJ7）位于PC1的正方向区域；广东河源黑糯米酒位于PC2 的正方向区域；贵州黑糯米酒（HMJ9、HMJ10、HMJ11）位于PC2的正方向，主要与乳酸有相关联，这表明乳酸可以作为贵州黑糯米酒的特征性有机酸以区分其他地域的样品。

表2 HPLC法测定黑糯米酒中10种有机酸含量Table 2 Contents of 10 organic acids in black glutinous rice wine detected by HPLC

图6 11种黑糯米酒样品中有机酸主成分分析Fig.6 Principal component analysis of organic acids in 11 black glutinous rice wine samples

2.3 方法学研究

2.3.1 精密度实验

按1.3.3中（1）的色谱条件，取有机酸标准母液10 mL于50 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，过0.22 μm水系滤膜后，连续进样6次，同时对10种有机酸的峰面积进行测定，计算其相对标准偏差值（RSD），仪器精密度实验结果如表3所示。

由表3可知，10种有机酸的RSD均在0.60%以下，故使用本研究优化的色谱条件测定黑糯米酒中10种有机酸时具有良好的精密度。

表3 精密度试验结果Table 3 Results of precision tests

2.3.2 重复性实验结果

取HMJ6黑糯米酒样品6份，过0.22 μm水系滤膜后在不同时间段（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）分别进样，色谱条件同1.3.3中（1），测定样品中10种有机酸的含量，同时计算其RSD。结果如表4所示。

由表4可知，10种有机酸的RSD均在1.00%以下，因而使用该研究优化后的色谱条件测定黑糯米酒中10种有机酸具有良好重复性。

表4 重复性试验结果Table 4 Results of repeatability tests

2.3.3 加标回收实验结果

按照1.3.3中（1）的色谱条件进行加标回收率实验，其结果如表5所示。

表5 加标回收率试验结果Table 5 Results of standard recovery rate tests

续表

由表5可知，10种有机酸的平均回收率在94.39%～104.73%之间，表明该检测方法准确度高，因而使用本研究优化的色谱条件测定黑糯米酒中10种有机酸时可以满足实验要求。

通过对黑糯米酒中有机酸测定的色谱条件进行优化，建立了黑糯米酒中有机酸快速检测的方法，即色谱条件：流动相为磷酸二氢钠溶液浓度0.03 mol/L，不加甲醇，pH值2.90；进样量10 μL；检测器为G1315D；ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱温35 ℃；流速0～4.00 min，流速为1.0 mL/min；4.00～10.00为0.30 mL/min；10.00 min后流速为1.0 mL/min。检测波长210 nm。与杨成聪[16]建立的HPLC法测定米酒中有机酸的方法有所差异，差异主要表现在流动相、流动相浓度、柱温、pH值的不同，可能是所用仪器类型及型号和色谱柱的不同，在实验中也发现，同样的仪器、色谱柱及相同的条件，不同型号仪器的检出效果差异很大。同时，与之检出的7种有机酸相比，本研究建立的方法更优，同时检出的有机酸种类更多（10种）。此外，与韩晓鹏[17-20]对果酒和猕猴桃酒中有机酸测定的方法比较可知，他们所建立的HPLC法测定有机酸检测时间较长（20 min），且同时检测有机酸种类（4种）较少，本实验所建立的有机酸测定方法可同时分析检测10种有机酸，且10种有机酸都能在10 min以内完成检测，达到基线分离。该方法可对黑糯米酒中有机酸进行快速检测分析，从而提高分析检测效率，降低实验成本。

3 结论

研究建立了应用高效液相色谱法测定黑糯米酒中草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、焦谷氨酸和琥珀酸含量的方法。研究表明：检测器为二极管阵列，检测波长210 nm，色谱柱：ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为35 ℃，流动相为0.03 mol/L的磷酸二氢钠溶液，pH值为2.90，在0～4.00 min，流速为1.0 mL/min；4.00～10.00 min流速为0.30 mL/min；10.00 min后流速为1.0 mL/min。黑糯米酒中的10种有机酸均在10 min内得到有效分离，可以实现黑糯米酒中有机酸含量的快速检测分析。标准曲线相关系数在0.999 1～1.000，重复性试验相对标准偏差为0.15%～0.87%，精密性实验相对标准偏差为0.024%～0.543%，检出限为0.014 9～0.219 0 mg/L，样品加标回收率在94.39%～104.73%。应用该方法分析黑糯米酒中有机酸，可知不同酒样中有机酸种类和含量有所差异，可明确不同酒样中的主要有机酸。