2015-2018年广东省猪流行性腹泻病毒M基因的遗传进化分析

赵贤杰 ， 张天佑 ， 李 舜 ， 李桂珍 ， 谢宏林 ， 李康健 ，张 熙 ， 付 强，3 ， 马春全,3 , 陈胜锋

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院 ， 广东 佛山 528225 ； 2.广州长隆野生动物世界 ， 广东 广州 511430 ； 3.佛山佛科院动物医院有限公司 ， 广东 佛山 528225)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，发病迅速、传播速度极快。该病多发于冬春季节，但近几年发生了变化，在天气炎热时也偶有发生[1]。该病的临床表现主要以排黄色水样稀粪、呕吐、脱水，新生仔猪发病率及死亡率高为特征。至今，PEDV在中国、越南、美国、匈牙利、加拿大、法国等多个国家均有报道，给全球养猪业造成严重的经济损失[2]。近年来，我国许多地区PEDV毒株均出现变异趋势，使PED防制难度增加，导致该病在国内流行，造成仔猪大量死亡，经济损失严重，威胁了我国养猪业发展[3-4]。

PEDV为有囊膜的单股正链RNA病毒，存在分别由S基因、E基因、M基因和N基因编码的纤突蛋白(Spike protein，S)、小包膜蛋白(Envelope, E)、膜糖蛋白(Membrane,M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid, N)4种结构蛋白[5]。其中M蛋白能诱导机体产生针对病毒的中和抗体，在病毒粒子组装和出芽过程中具有重要的作用[6]。M基因PEDV毒株间高度保守，可以体现田间毒株的多样性及其与临床毒株之间的遗传关系，对PEDVM基因的检测和分析有助于了解目前我国PEDV流行毒株的流行类型，同时可以作为PEDV分子分群的重要依据[7-8]。近几年广东PED多发，疫苗保护率越发低下。因此，本试验于2016年5月-2018年12月在广东省部分地区发生严重腹泻的规模猪场采集了45份因严重腹泻而死亡的仔猪小肠样品，检测并鉴定了22份PEDV阳性病料，对其M基因进行克隆测序以及遗传进化分析，探究广东省PEDV的流行变异情况，以期为当地防控该病制定防制措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料样品 45份疑似感染PEDV的仔猪小肠样品采集自广东省云浮、清远等发生严重腹泻的规模化猪场。

1.2 主要试剂 TRIzol试剂,购自Invitrogen公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL-2 000 DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T载体、DH5α感受态细胞，均购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收试剂盒,购自Axygen公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇等试剂均为分析纯，购自广州鼎国生物技术有限公司。

1.3 引物设计 参考黄冬妮论文中PEDVM基因引物进行合成[9]，即M-F：5′- TCACTTGTCACCGGTTGTGT-3′，M-R：5′-GAGATAATGGCACCCGTTTG-3′,预期扩增产物大小为867 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 病毒总RNA的提取及RT-PCR扩增 将采集的小肠样品反复研磨匀浆，按TRIzol试剂使用说明书提取其总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板进行PCR扩增。扩增体系50 μL，PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 目的基因的克隆与序列分析 PCR产物经胶回收后克隆至pMD19-T载体中，重组阳性质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序的PEDVM基因应用DNASTAR 5.0软件与 GenBank登录的参考病毒株比对分析，并应用MEGA7软件进行系统进化树分析。

2 结果

2.1M基因的RT-PCR扩增结果 对采集的45份仔猪小肠样品采用RT-PCR扩增PEDVM基因，结果显示，22份样品扩增出867 bp的片段，与预期的M基因相符(图1)。

图1 PEDV M基因RT-PCR扩增结果

2.2M基因序列分析结果 按样品采集地将22株广东流行PEDV毒株M基因序列分别命名为：CH/GDQY/2015(广东清远)、CH/GDLD/2015(广东龙洞)、CH/GDLC/2015(广东龙川)、CH/GDLF/2015(广东陆丰)、CH/GDQX/2015(广东清新)、CH/GDZJ/2016(广东紫金)、CH/GDGY/2016(广东高要)、CH/GDHD/2016(广东惠东)、CH/GDHS/2016(广东鹤山)、CH/GDYF/2016(广东云浮)、CH/GDYJ/2016(广东阳江)、CH/GDXN/2016(广东兴宁)、CH/GDST/2017(广东汕头)、CH/GDHY/2017(广东惠阳)、CH/GDHD/2017(广东惠东)、CH/GDSH/2017(广东四会)、CH/GDYD/2018(广东英德)、CH/GDLC/2018(广东龙川)、CH/GDQX/2018(广东清新)、CH/GDZJ/2017(广东紫金)、CH/GDGM/2018(广东高明)、CH/GDZQ/2018(广东肇庆)。

将获得的22株广东地区PEDV流行株M基因的测序结果与GenBank 中PEDV参考株M基因进行同源性分析(用于M基因序列比对的PEDV参考株见图2)。结果显示，22株广东流行株间M基因核苷酸序列同源性为97.5%～100.0%，其中CH/GDZQ/2018与CH/GDZJ/2017、CH/GDGY/2016、CH/GDHS/2016的同源性最低为97.5%；CH/GDQX/2018 与CH/GDZJ/2017的同源性最高为100%。22株广东流行株与华南地区参考株M基因核苷酸序列同源性为97.7%～99.9%，其中流行株CH/GDZQ/2018与参考株GDJM-1205的同源性最低为97.7%；CH/GDLC/2015、CH/GDSH/2017、CH/GDHD/2017分别与参考株CHN/SH、GDXS5的同源性最高为99.9%。此外，22株流行株与国内参考株LJB/03的同源性为96.9%～97.5%，与国内较早分离株CH/S和经典毒株的CV777的同源性分别为97.5%～98.1%、97.7%～98.2%；除了分离株CH/GDSH外，22株流行株与国内其他地区参考株的同源性为96.9%～99.7%。结果表明，22株广东PEDV流行株的同源性较高，亲缘关系紧密，而与经典毒株和国内较早分离株同源性较低。推测近年来广东PEDV流行株可能形成独特进化分支。

图2 基于M基因的广东省PEDV系统发育树

将获得的22株广东PEDV流行株M基因测序结果与GenBank中的PEDV参考株M基因构建的遗传进化树结果显示(图2)，22株广东PEDV流行株与部分国外毒株以及华南地区分离株均属于II、III群，但是亲缘关系较近，处于同一分支；与大部分均属于I群的代表性毒株、疫苗株非一系，亲缘关系较远，如国内早期分离株CH/S、经典毒株CV777、韩国株KRPEDV-9-Vaccine、泰国株M_NIAH100541_08、日本株JMe2、英国株Brl/87等。以上结果均表明，近年来广东PEDV流行株M基因发生基因变异，在广东已成为优势毒株，并发展形成独特进化分支。

3 讨论

典型的PED具有明显的季节性，一般多发于冬春季节，但是近年来在天气炎热的时候偶有发生。我国在很长一段时间内通过免疫接种PEDV、TGEV和PRo V二联疫苗或三联疫苗来预防猪的腹泻,取得了一定的效果。但自2006年开始,腹泻灭活苗和弱毒苗广泛使用的猪场也暴发了严重的腹泻,给我国养猪业带来的经济损失较大[9-10]。本试验通过对2016-2018年广东省内各地分离得到的22株PEDV流行株M基因序列的遗传进化分析，了解到广东PEDV流行株存在基因变异的现象，形成了独特的流行进化分支，为广东省对PED的防制以及疫苗的研制提供理论依据。