黄毛耳草化学成分及其中车叶草苷和京尼平苷的含量测定研究

杨娇，范海贞，阮铃杰，冯停停，叶淼,2

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建省中药资源研究与开发利用重点实验室，福建 福州 350122)

黄毛耳草(Hedyotischrysotricha)是茜草科(Rubiaceae)耳草属(Hedyotis)植物黄毛耳草的全草，广泛分布于江西、福建、浙江、江苏等地[1]。黄毛耳草收录于福建省、浙江省及江苏省的地方中药材标准[2-4]。中医理论认为该药材具有清热除湿、消肿解毒、活血舒筋之功效，临床上主要用于治疗急性肝炎、肾炎水肿、肠炎、痢疾、跌打肿痛等[1]。此外，黄毛耳草为肠炎宁片、伤湿丸等多个国药准字中药成方制剂的主要组方药材。目前已报道的黄毛耳草的化学成分有环烯醚萜苷、三萜、黄酮、甾醇、生物碱等[5-6]。其中槲皮素、乌苏酸及鸡屎藤苷甲酯的含量测定方法已见报道[5]。2012年，叶淼等[6]从黄毛耳草中共分离得到5个化合物，包括1个甾醇[(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol]，3个三萜(乌苏酸、坡模酸、3β,6β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid)及1个环烯醚萜苷(鸡屎藤苷甲酯)；基于前期研究基础，本文报道了黄毛耳草14个化学成分的分离与结构鉴定。其中7个化合物(1～3、6、7、12、13)为耳草属植物中首次分离，14曾在同属植物脉耳草(H.vestita)中得到[7]，但为首次从黄毛耳草中分离。同时，本文采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)方法对本次分离得到的主要成分车叶草苷和京尼平苷进行含量测定。

1 设备与材料

1.1 设备 LC-20A分析兼半制备高效液相色谱仪(配SPD-M20A二极管阵列及Sedex-85型ELSD检测器，日本岛津公司)；YMC-pack ODS-A色谱柱(4.6/10 mm×250 mm,5 μm)；Bruker Daltonics micrOTOF-QⅡ质谱仪、Bruker AVANCE DRX-500核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；柱层析硅胶、薄层色谱硅胶GF254(青岛海洋化工厂)；MCI微孔树脂(CHp20p，75～150 μm，日本三菱)；柱色谱试剂均为分析纯(中国医药集团上海化学试剂公司)。AR224CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；KQ-500DE型医院数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；TD5A-WS医用离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 材料 10批次黄毛耳草药材采集于安徽省亳州药材市场，经福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定为茜草科植物黄毛耳草(H.chrysotricha)的干燥全草。其中批次为100115用于柱色谱分离用，其他批次用于含量测定分析，所有样本保存于福建中医药大学药用植物学标本实验室。车叶草苷和京尼平苷自制，纯度经HPLC-DAD大于98%，供含量测定用；色谱级甲醇(德国默克公司)；色谱纯甲酸(批号：A1309012，上海阿拉丁试剂有限公司)；色谱纯三氟乙酸(批号：8996174，北京迪马科技发展中心)。

2 方法与结果

2.1 提取与分离 将黄毛耳草(10.0 kg)全草以甲醇为溶剂进行热回流提取4次(4×20.0 L×6 h)。浓缩后，得甲醇提取物(500.3 g)。醇提物经硅胶柱梯度洗脱(CH2Cl2/MeOH，60∶1、40∶1、30∶1、15∶1、9∶1、5∶1、2∶1、0∶1)，得到7个组分Fr.1～7。其中Fr.2经硅胶柱，以石油醚(PE)/EtOAc(4∶1)洗脱，得4(67.02 mg)、5(125.78 mg)。Fr.3经硅胶柱色谱，CH2Cl2/EtOAc(20∶1→10∶1)梯度洗脱，得8(12.65 mg)、7(15.74 mg)。Fr.6经硅胶柱色谱，CH2Cl2/EtOAc(20∶1→10∶1)梯度洗脱，得3个亚组分Fr.6A～6C，其中Fr.6B经半制备高效液相色谱(乙腈/水/TFA，95∶5∶0.1；流速：3 mL·min-1)，得2(8.95 mg，tR= 43.3 min)及1(13.42 mg，tR= 48.13 min)。Fr.6C经MCI柱色谱(MeOH/H2O，85∶15)和Sephadex LH-20柱色谱(CH2Cl2/MeOH，2∶1)纯化，得3(8.56 mg)和6(12.68 mg)。Fr.7经硅胶柱(EtOAc/EtOH，15∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)，得5个亚组分Fr.7A～7E；Fr.7B经MCI柱色谱(1∶1→9∶1，MeOH/H2O)得到9(2.23 g)、11(267.28 mg)和12(17.83 mg)。Fr.7D经反复硅胶柱分离(CH2Cl2/MeOH/H2O，4∶1，3∶1，2∶1)，并用Sephadex LH-20(MeOH)纯化，得到10(11.85 mg)、13(14.66 mg)和14(16.37 mg)。

2.2 结构鉴定 化合物1：无色结晶(甲醇)，ESIMSm/z：471 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,pyridine-d5)δ:4.86(1H,m,H-3),4.16(1H,brs,H-6),2.96(1H,t,J=12.5 Hz,H-4a),2.33(1H,overlapped,H-4b),1.65(3H,s,H3-19),0.99(3H,d,J=6.4 Hz,H3-21),0.90(3H,t,J=7.3 Hz,H3-29),0.88(3H,d,J=6.6 Hz,H3-26),0.85(3H,d,J=6.6 Hz,H3-27),0.75(3H,s,H3-18);13C-NMR(125 MHz,pyridine-d5)δ:32.2(C-1),33.00(C-2),67.0(C-3),42.5(C-4),75.5(C-5),75.9(C-6),35.4(C-7),30.9(C-8),45.6(C-9),38.8(C-10),21.4(C-11),40.3(C-12),42.7(C-13),56.2(C-14),24.3(C-15),28.3(C-16),56.2(C-17),12.0(C-18),16.9(C-19),36.2(C-20),19.6(C-21),33.9(C-22),26.1(C-23),45.7(C-24),29.1(C-25),19.6(C-26),18.9(C-27),23.0(C-28),11.8(C-29)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故推测1极可能为(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol。然其C-24的绝对构型仍需进一步确定。前人研究表明[9]，甾醇类A～C环结构的改变对于侧链碳原子的NMR数据影响甚微。且可根据侧链碳原子(尤其是C-23～C-27)的碳谱特征来确定C-24的绝对构型，从而区分24R/S差向异构体。1的C-23～C-27的碳谱数据(δ26.1,45.7,29.1,19.6,18.9)与sitosterol的(δ26.1，45.9，29.2，19.8，19.1)高度一致，而与sitosterol的24S差向异构体clionasterol的C-23～C-27碳谱数据(δ26.4，46.1，29.0，19.1，19.6)有明显差异，故将1的C-24绝对构型定为R，而化合物1最终确定为(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol。

化合物2：白色结晶(氯仿/甲醇，2∶1)，ESIMSm/z:469 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,pyridine-d5)δ:5.19(1H,dd,J=15.0,9.2 Hz,H-22 or H-23),5.04(1H,dd,J=15.5,9.1 Hz,H-22 or H-23),4.87(1H,m,H-3),4.16(1H,brs,H-6),2.98(1H,t,J=12.5 Hz,H-4a),2.33(1H,overlapped,H-4b),1.66(3H,s,H3-19),1.08(3H,d,J=6.5 Hz,H3-21),0.89(3H,overlapped,H3-27),0.87(3H,overlapped,H3-29),0.84(3H,overlapped,H3-26),0.76(3H,s,H3-18);13C-NMR(125 MHz,pyridine-d5)δ:31.2(C-1),32.4(C-2),66.1(C-3),41.2(C-4),74.9(C-5),74.4(C-6),34.8(C-7),30.5(C-8),44.9(C-9),38.3(C-10),21.1(C-11),40.2(C-12),42.8(C-13),56.4(C-14),24.3(C-15),29.0(C-16),55.8(C-17),12.8(C-18),16.8(C-19),40.4(C-20),21.3(C-21),138.6(C-22),129.1(C-23),51.0(C-24),31.8(C-25),21.3(C-26),19.2(C-27),25.2(C-28),12.4(C-29)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定2为24ξ-ethylcholest-22E-ene-3β,5α,6β-triol。

化合物3：白色粉末(氯仿)，ESIMSm/z:453 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.59(1H,dd-like,J=5.2,1.4 Hz,H-6),3.83(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),3.57(1H,m,H-3),0.98(3H,s,H3-19),0.91(3H,d,J=6.7 Hz,H3-21),0.83(3H,t,J=7.4 Hz,H3-29),0.81,0.79(each 3H,d,J=6.9 Hz,H3-26,27),0.67(3H,s,H3-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:37.1(C-1),31.6(C-2),71.5(C-3),41.9(C-4),143.5(C-5),125.3(C-6),73.4(C-7),39.6(C-8),48.4(C-9),36.5(C-10),21.8(C-11),42.9(C-12),41.0(C-13),55.8(C-14),26.4(C-15),28.3(C-16),55.4(C-17),11.9(C-18),19.2(C-19),36.2(C-20),19.0(C-21),33.9(C-22),26.2(C-23),45.9(C-24),29.2(C-25),19.8(C-26),18.9(C-27),22.8(C-28),12.0(C-29)。以上数据与文献数据高度相似[11]，推断化合物3可能为5-stigmasten-3β,7β-diol。与1情况类似，3的C-23～C-27的碳谱数据特征与sitosterol[9]高度一致，故C-24为R，3确定为5-stigmasten-3β,7β-diol。

化合物4：无色针状结晶(氯仿)，ESIMSm/z:437 [M+Na]+。用TLC法于多种溶剂系统(石油醚/丙酮，6∶1；石油醚/乙酸乙酯，4∶1；环己烷-异丙醇，7∶1)分别展开，4与豆甾醇对照品Rf值及斑点颜色均一致，故鉴定4为豆甾醇。

化合物5：无色针状结晶(氯仿)，ESIMSm/z:437 [M+Na]+。用TLC方法于多种溶剂系统(石油醚-丙酮、三氯甲烷-甲醇、环己烷-乙酸乙酯)分别展开，化合物5与β-谷甾醇对照品Rf值及斑点颜色均一致，故鉴定化合物5为β-谷甾醇。

化合物6：白色粉末(甲醇)，ESIMSm/z:527 [M+Na]+。经与文献[12]报道的碳谱数据进行对照，将6最终确定为hyptatic acid B。然而，前人文献中仅报道了该化合物特征信号的1H-NMR数据(H-2β、3α、5α、12、18β；H2-24；Me-23、25～27、29、30),而完整的氢谱数据未见报道。本文通过综合分析化合物的HSQC和HMBC数据，完整归属了氢谱数据。具体见表1及图1。

表1 化合物6(CD3OD)的1H-NMR、13C-NMR及HMBC相关数据

图1 化合物6的结构式以及关键HMBC相关

化合物7：白色针状固体(氯仿/甲醇，2∶1)，ESIMSm/z:495 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,pyridine-d5)δ:5.48(1H,m,H-12),4.86(1H,m,H-6),3.04(1H,m,H-3),1.27(3H,s,H3-23),1.24(3H,s,H3-27),1.10(3H,s,H3-26),1.04(3H,s,H3-24),1.02(3H,d,J=6.2 Hz,H3-30),0.97(3H,J=6.6 Hz,H3-29),0.91(3H,s,H3-25)；13C-NMR(125 MHz,pyridine-d5)δ:37.1(C-1),23.4(C-2),78.3(C-3),36.7(C-4),56.0(C-5),67.2(C-6),41.2(C-7),40.1(C-8),48.2(C-9),39.0(C-10),23.4(C-11),125.7(C-12),138.3(C-13),42.6(C-14),28.3(C-15),24.6(C-16),47.7(C-17),53.3(C-18),39.1(C-19),39.2(C-20),30.8(C-21),41.1(C-22),28.4(C-23),18.5(C-24),16.9(C-25),17.2(C-26),23.7(C-27),179.5(C-28),17.7(C-29),21.1(C-30)。其NMR数据与文献报道基本一致[13]，故将7定为6β-hydroxyursolic acid。

化合物8：白色粉末(氯仿)，ESIMSm/z:479 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.30(1H,brs,H-12),3.24(1H,dd,J=11.3,3.8 Hz,H-3α),2.91(1H,m,H-18),1.19(3H,s,H3-30),1.03(3H,s,H3-29),0.93(3H,s,H3-27),0.94(3H,s,H3-26),0.91(3H,s,H3-25),0.78(3H,s,H3-24),0.74(3H,s,H3-23)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:38.4(C-1),27.1(C-2),78.4(C-3),38.5(C-4),56.2(C-5),18.3(C-6),32.8(C-7),39.1(C-8),47.5(C-9),36.6(C-10),22.6(C-11),122.1(C-12),143.6(C-13),41.3(C-14),27.6(C-15),23.2(C-16),46.2(C-17),41.0(C-18),45.8(C-19),30.3(C-20),33.5(C-21),32.3(C-22),27.8(C-23),15.2(C-24),15.5(C-25),16.4(C-26),25.6(C-27),180.2(C-28),32.8(C-29),23.3(C-30)。经文献对照[14]，鉴定8为齐墩果酸。

化合物9：白色晶体(甲醇)，ESIMSm/z:437 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.30(1H,d,J=2.0 Hz,H-3),5.99(1H,d,J=1.1 Hz,H-1),5.76(1H,d,J=1.6 Hz,H-7),5.59(1H,brd,J=6.5 Hz,H-6),4.76,4.67(1H×2,dd,J=14.3,1.3 Hz,H-10a,10b),4.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),3.92(1H,dd,J=11.9,2.1 Hz,H-6a),3.67(1H,dd,J=12.0,6.4 Hz,H-6b),3.35-3.34(3H,overlapped,H-3,9,4),3.29(1H,t,J=9.0 Hz,H-5),3.19(1H,t,J=8.9 Hz,H-2),2.13(3H,s,CH3COO)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:93.3(C-1),150.3(C-3),106.2(C-4),37.5(C-5),86.3(C-6),128.9(C-7),144.3(C-8),45.2(C-9),60.9(C-10),172.6(C-11),100.1(C-1),74.6(C-2),78.3(C-3),71.5(C-4),77.9(C-5),62.8(C-6),172.2(CH3CO),20.6(CH3CO)。以上数据与文献报道基本一致[15]，鉴定9为车叶草苷。

化合物10：无色针状固体(甲醇)，ESIMSm/z:455 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.65(1H,s,H-3),5.99(1H,s,H-7),5.01(1H,d,J=8.5 Hz,H-1),4.94,4.80(1H×2,d,J=15.2 Hz,H-10a,10b),4.83(1H,overlapped,H-6),4.72(1H,d,J=7.85 Hz,H-1),3.84(1H,dd,J=12.5,2.4 Hz,H-6a),3.62(1H,dd,J=12.5,5.4 Hz,H-6b),3.38(1H,t,J=8.7 Hz,H-3),3.27-3.21(3H,m,H-4,5,2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:101.6(C-1),155.1(C-3),42.7(C-5),75.4(C-6),131.9(C-7),145.9(C-8),46.3(C-9),63.9(C-10),172.5(C-11),100.8(C-1),75.2(C-2),78.8(C-3),71.8(C-4),78.1(C-5),63.3(C-6),171.2(CH3CO),20.9(CH3CO)，以上数据与文献基本一致[15]，鉴定10为车叶草酸。

化合物11：白色粉末(甲醇)，ESIMSm/z:411 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.51(1H,s,H-3),5.80(1H,s,H-7),5.16(1H,d,J=7.6 Hz,H-1),4.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),4.31(1H,brd,J=14.5 Hz,H-10a),4.18(1H,brdd,J=14.5,1.5 Hz,H-10b),3.86(1H,dd,J=11.5,3.5 Hz,H-6a),3.64(1H,dd,J=11.5,5.4 Hz,H-6b),3.39(1H,m,H-3),3.71(3H,s,COOCH3),3.29(1H,overlapped,H-4),3.29(1H,overlapped,H-5),3.22(1H,overlapped,H-5),3.22(1H,overlapped,H-2),2.80,2.09(1H,dd,H-6a,6b),2.72(1H,dd,J=8.0,7.5 Hz,H-9);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:98.6(C-1),153.6(C-3),112.7(C-4),37.0(C-5),40.0(C-6),129.4(C-7),145.1(C-8),47.4(C-9),61.8(C-10),169.9(C-11),100.8(C-1),75.3(C-2),78.2(C-3),72.2(C-4),78.6(C-5),63.1(C-6),52.0(CH3O)。经文献对照[16]，鉴定11为京尼平苷。

化合物12：浅黄胶状固体(甲醇)，ESIMSm/z:469 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD) δ:7.64(1H,s,H-3),6.02(1H,brs,H-7),5.05(1H,d,J=7.0 Hz,H-1),4.95,4.76(1H×2,d,J=14.6 Hz,H-10a,b),4.80(1H,m,H-6),4.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),3.92(1H,dd,J=11.9,2.1 Hz,H-6a),3.67(1H,dd,J=11.9,6.4 Hz,H-6b),3.35(1H,m,H-3),3.34(1H,m,H-4),3.29(1H,t,J=9.5,8.0 Hz,H-5),3.19(1H,t,J=9.4,8.0 Hz,H-2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD) δ:101.1(C-1),155.1(C-3),107.9(C-4),42.3(C-5),75.2(C-6),130.5(C-7),145.2(C-8),45.5(C-9),66.3(C-10),169.2(C-11),172.2(C-12),100.3(C-1),74.3(C-2),78.2(C-3),71.2(C-4),77.7(C-5),63.2(C-6),52.5(OCH3),20.1(CH3OCO)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物12为aitchisonide A。

化合物13：浅黄固体(甲醇)，ESIMSm/z:267 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.06(1H,dd,J=15.8,0.8 Hz,H-7),5.78(1H,dd,J=15.8,6.2 Hz,H-8),4.34(1H,m,H-9),4.05(1H,m,H-3),1.76(2H,m,H2-4),1.65(1H,dd,J=12.3,2.6 Hz,H-2ax),1.44(1H,t,J=12.1 Hz,H-2eq),1.29(3H,d,J=6.5 Hz,H3-10),1.20(3H,s,H3-11),1.13(3H,s,H3-13),0.84(3H,s,H3-12)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:41.0(C-1),46.6(C-2),65.9(C-3),45.8(C-4),78.1(C-5),79.4(C-6),131.3(C-7),136.1(C-8),69.7(C-9),24.3(C-10),27.2(C-11),26.4(C-12),27.5(C-13)。与文献数据对照后[18]，鉴定13为3S,5R,6R,9S-tetrahydroxy-7E-megastigmene。

化合物14：浅黄色固体(甲醇)，ESIMSm/z:409 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.87(1H,d,J=1.5 Hz,H-4),5.86(2H,m,H-7,8),4.42(1H,m,H-9),4.34(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),3.97(1H,dd,J=12.0,2.5 Hz,H-6a),3.67(1H,dd,J=12.0,5.5 Hz,H-6b),3.36(1H,t,J=9.0 Hz,H-3),3.25(1H,t,J=9.0 Hz,H-4),3.22(1H,m,H-5),3.17(1H,dd,J= 9.0,8.0 Hz,H-2),2.52,2.15(1H×2,d,J=17.0 Hz,H-2a,2b),1.92(3H,d,J=1.5 Hz,H3-13),1.29(3H,d,J=6.5 Hz,H3-10),1.04(3H,s,H3-12),1.03(3H,s,H3-11)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:43.1(C-1),50.8(C-2),201.6(C-3),127.3(C-4),168.2(C-5),80.1(C-6),131.6(C-7),135.6(C-8),77.3(C-9),23.8,24.7(1-CH3×2),21.8(9-CH3),102.8(C-1),75.3(C-2),78.2(C-3),71.7(C-4),78.1(C-5),62.9(C-6)。经文献对照[19]，鉴定14为(6S,9R)-roseoside。

2.3 黄毛耳草中车叶草苷和京尼平苷的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 取车叶草苷对照品和京尼平苷对照品，分别用甲醇配制得车叶草苷1.28 mg·mL-1和京尼平苷1.50 mg·mL-1的对照品溶液，进一步用50%甲醇稀释得含车叶草苷128.00 μg·mL-1和京尼平苷30.00 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取黄毛耳草粉末(过50目筛)约0.50 g，置50 mL锥形瓶中，加50%甲醇25 mL，超声功率500 W，频率40 kHz，提取30 min，冷却；补足减失重，摇匀，滤过，得供试品溶液。

2.3.3 色谱条件 色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)(13∶87)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃；进样量10 μL。该色谱条件下，供试品中待测峰分离良好，见图2。

图2 供试品(A)和对照品(B)HPLC-DAD色谱图

2.3.4 线性关系考察 精密吸取车叶草苷和京尼平苷对照品，配制得到车叶草苷浓度分别为6.40、12.80、25.60、76.80、102.40、128.00 μg·mL-1，京尼平苷浓度分别为1.50、3.00、6.00、18.00、24.00、30.00 μg·mL-1的对照品溶液。按“2.3.3”项下色谱条件进样分析，分别以车叶草苷对照品浓度、京尼平苷对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得车叶草苷和京尼平苷回归方程分别为Y1=7.94X-3.59(r=0.999 0)和Y2=15.97X+0.29(r=0.999 3)。

2.3.5 精密度试验 精密吸取“2.3.1”项下对照品溶液10 μL，按“2.3.3”项下色谱条件，连续6针，得车叶草苷、京尼平苷峰面积的RSD分别为0.75%、2.44%，表明本仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 精密称取“2.3.2”项下制备所得的供试品溶液，分别于0、2、6、9、12、24 h，精密吸取10 μL，按“2.3.3”项下色谱条件进样分析，计算各色谱峰面积的RSD，结果车叶草苷、京尼平苷峰面积的RSD分别为1.11%、2.62%，表明供试品溶液中车叶草苷和京尼平苷在24 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 按“2.3.2”项下，取同批次黄毛耳草，按照供试品制备方法平行制备6份，并按“2.3.3”项下色谱条件，进行测定，测得车叶草苷、京尼平苷含量均值分别为2.26、0.32 mg·g-1，含量的RSD分别为1.48%、2.34%，表明本方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取重复性试验同批次黄毛耳草，精密称取0.25 g，平行9份，分别加入相当于样品中车叶草苷、京尼平苷含量的50%、100%及150%的车叶草苷对照品和京尼平苷对照品，按“2.3.2”项制备样品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样分析，计算加样回收率及RSD。结果表明，车叶草苷、京尼平苷的平均加样回收率分别为103.19%、95.06%，RSD分别为2.35%、3.93%，回收率良好，见表2所示。

表2 车叶草苷和京尼平苷的加样回收率

2.3.9 样品含量测定 分别精密称取不同批次黄毛耳草提取物，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，并按“2.3.1”项下色谱条件进样10 μL，测定各样品中车叶草苷、京尼平苷含量分别为0.733～2.282以及0.080～0.328 mg·g-1，结果见表3。

表3 10批样品中车叶草苷成分、京尼平苷成分的含量(n=3)

3 讨论

本次从该植物中共分离得到14个化合物(包括5个甾体、3个三萜、4个环烯醚萜、2个降碳倍半萜)，分别鉴定为(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol(1)、24ξ-ethylcholest-22E-ene-3β,5α,6β-triol(2)、5-stigmasten-3β,7β-diol(3)、豆甾醇(4)、β-谷甾醇(5)、hyptatic acid B(6)、6β-hydroxyursolic acid(7)、齐墩果酸(8)、车叶草苷(9)、车叶草苷酸(10)、京尼平苷(11)、aitchisonide A(12)、3S,5R,6R,9S-tetrahydroxy-7E-megastigmene(13)及(6S,9R)-roseoside(14)，首次基于2D-NMR数据对化合物6的氢谱数据进行了完整归属。

根据黄毛耳草化学成分相关文献及本次分离工作结果，化合物含量比较高的成分且结构类型相对丰富的为环烯醚萜苷类(除了本次分离得到的4个外，还有车叶草苷、去乙酰车叶草苷、6′-乙酰车叶草苷、6′-乙酰去乙酰车叶草苷、车叶草酸、去乙酰车叶草酸、鸡屎藤苷甲酯、马钱子、乙酰鸡屎藤苷甲酯、耳草苷、车叶草酸乙酯，6β-羟基京尼平[5]，其次为三萜类。其中，环烯醚萜苷类化合物具有广泛的药理活性。如：车叶草苷(9)和车叶草酸(10)均能通过抑制NF-κB/MAPK信号通路[20-21]有效减少炎性介质产生，京尼平苷(11)具有抗炎、抗病毒[22]等作用。

此外，黄毛耳草为肠炎宁片、伤湿丸等中成药的主要药味，其工艺为水提取。而环烯醚萜苷类成分具有较好的水溶性，因此环烯醚萜苷类化合物很有可能是黄毛耳草传统功效“清热除湿，解毒消肿，活血舒筋”以及现代临床治疗肝炎等多种炎症的重要物质基础，同时也可能是黄毛耳草作为中药成方制剂“肠炎宁”“伤湿丸”“治伤软膏”中药效贡献成分之一。

关于黄毛耳草的质量控制，李晶等[23]以高效液相色谱法，采用鸡屎藤苷甲酯为指标对采自江西、福建、浙江和广西等不同产地的黄毛耳草中含量进行测定，应萍等[24]建立了黄毛耳草的薄层色谱法，分别检测了黄毛耳草中环烯醚萜类(鸡屎藤苷甲酯)、黄酮类和内酯类成分。另外也有学者开展了槲皮素和三萜类乌苏酸的含量测定[5]，但是到目前为止，对黄毛耳草环烯醚萜苷的质控相对薄弱。

本试验选择本次分离过程中量最大的两个成分(均为环烯醚萜苷)，即车叶草苷和京尼平苷作为对照品，对10个批次市售的黄毛耳草进行含量测定分析，通过比较以下色谱体系：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液，发现以乙腈-0.1%甲酸溶液(13∶87)等度洗脱，车叶草苷和京尼平苷可以基线分离，并且两个成分均在240 nm下有最大吸收波长，故选择240 nm作为检测波长，经测定发现车叶草苷以及京尼平苷的含量范围分别为0.733～2.282和0.080～0.328 mg·g-1，提示环烯醚萜苷类成分车叶草苷、京尼平苷也可以作为黄毛耳草环烯醚萜苷类质量控制的Q-marker成分。