重组促红细胞生成素对脂肪肝缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡和炎症因子的影响

常顺伍，韩晓玉，宫晓光，王葆春

海南省人民医院普通外科，海南 海口 570311

肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是指肝脏组织缺血一段时间后重新恢复血流，但损伤却进一步加重的现象[1]。HIRI是肝脏外科手术常见的病理过程，同时也是导致肝部分切除术和肝移植术术后肝功能衰竭的主要原因，减轻术中HIRI有助于降低手术对肝功能的影响[2]。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种酸性糖蛋白，EPO通过调节红细胞生成从而增加组织供氧，对缺血再灌注器官的保护作用，但存在感染、输血反应等潜在危险[3]。重组促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)是利用人工基因技术将EPO基因转入哺乳动物细胞内而得，研究证实rHuEPO对大鼠脑缺血再灌注损伤后血脑屏障内皮屏障抗原及通透性具有良好的保护作用[4-5]，可降低炎症反应及细胞黏附分子-1表达，但关于rHuEPO对HIRI大鼠细胞凋亡和炎症因子影响的研究较少，因此本文就此问题展开研究，以期为临床上HIRI的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 高脂饲料饲养的无特定病原体(specific pathogen free，SPF)雄性SD大鼠90只，购于广东省医学实验动物中心，体质量250～300 g，饲养温度20℃～25℃，湿度45%～60%，室内风速0.1～0.2 m/s，采用随机数表法分为假手术组、模型组和rHuEPO组，每组30只。

1.2 方法

1.2.1 建模与干预 所有大鼠建模前禁食12 h，自由饮水，腹腔注射10%的水合氯醛400 mg/kg麻醉，仰卧位固定，常规腹部脱毛并消毒，经阴茎背静脉注射稀释肝素(南京新百药业有限公司，国药准字H32026497，规格2 mL：5 000 U)400 mg/kg，取上腹正中切口入腹后进一步操作。假手术组：仅解剖分离肝十二指肠韧带，不阻断肝组织血流；模型组和rHuEPO：采用无创血管夹夹闭阻断肝中叶及左肝叶建立大鼠45%减体积HIRI模型，缺血时间45 min。干预方法：rHuEPO组于缺血前24 h时腹腔注射rHuEPO(哈药集团生物工程有限公司，国药准字S20050090，规格3 000 IU/瓶)4 000 IU/kg，假手术组和模型组于缺血前24 h腹腔注射等容量的生理盐水。

1.2.2 血液及肝组织标本采集 各组大鼠均随机分为再灌注后1 h、3 h和6 h三个亚组，每个亚组10只，均采集下腔静脉血3 mL，在2 500 r/min下离心10 min，离心半径6 cm，常规分离血清与血浆，留取血清、血浆保存于-20℃冰箱待测。所有大鼠在采血后处死，统一取左肝叶肝组织标本待测。

1.3 观察指标与检测方法

1.3.1 肝细胞凋亡情况 肝组织标本置于4%的多聚甲醛中24 h后常规石蜡包埋切片，切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水处理后，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling，TUNEL)标记肝组织凋亡细胞，在光学显微镜下观察，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕黄色，计数5个高倍视野(400倍)下细胞凋亡情况，细胞凋亡率=凋亡细胞数/视野下细胞总数×100%，计算平均每100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数表示作为凋亡指数。

1.3.2 肝组织病理形态学观察 肝组织切片后苏木精-伊红(HE)染色，在光镜下观察肝组织结构；切片取新鲜左叶肝组织约1 mm³，采用戊二醛(浓度2.5%)固定，1%的锇酸后固定，梯度乙醇脱水处理，环氧树脂包埋超薄切片，在JEM-100CX透射电镜(日本JEOL公司)下观察肝组织超微结构改变情况。

1.3.3 肝功能检测 采用日立7600系列全自动生化仪测定各亚组血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.3.4 炎症因子检测 采用试剂盒检测各亚组血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)，TNF-α检测试剂盒构图上海晶抗生物工程有限公司，LI-1检测试剂盒购于北京方程佰金科技有限公司，检测中严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3.5 氧化应激检测 采用黄嘌呤氧化酶法测定肝组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，采用硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平。

1.4 统计学方法 数据资料均采用SPSS22.0进行统计学分析，肝细胞凋亡指数、ALT、AST、TNF-α、IL-1、SOD及MDA等计量资料均符合正态分布，采用均数±标准差(x-±s)描述，两组比较采用独立样本t检验，三组比较、同组内不同亚组比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝细胞凋亡指数比较 模型组肝细胞凋亡指数高于rHuEPO组和假手术组，rHuEPO组高于假手术组，差异有统计学意义(P＞0.05)；随着再灌注时间的推移，模型组和rHuEPO组细胞凋亡指数均显著增高，再灌注3 h组高于再灌注1 h组，再灌注6 h组高于再灌注3 h组，差异有统计学意义(P＜0.05)；假手术组的不同亚组细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肝细胞凋亡指数比较(±s，%)

表1 各组大鼠肝细胞凋亡指数比较(±s，%)

注：与再灌注1 h比较，a P＜0.05；与再灌注3 h比较，b P＜0.05；与假手术组比较，c P＜0.05；与模型组比较，d P＜0.05。

假手术组模型组rHuEPO组F值P值30 30 30 3.28±0.63 27.86±2.87c 21.38±2.62cd 15.782＜0.05 3.56±0.83 37.24±3.65ac 28.65±2.74acd 14.657＜0.05 3.41±0.72 46.92±3.88abc 32.44±3.07abcd 14.879＜0.05

2.2 各组大鼠肝组织细胞形态变化病理观察 光镜下观察显示：与假手术组比较，模型组、rHuEPO组肝小叶结构紊乱，肝细胞水肿明显且伴有较多的空泡变性，可见间质充血水肿伴炎性细胞浸润，肝血窦变窄等，部分肝组织中央静脉有不同程度的淤血，模型组的情况较rHuEPO组更严重。电镜下观察显示：模型组、rHuEPO组细胞核呈不规则邹缩，核染色质明显浓缩和向边缘聚集，胞质中线粒体肿胀明显，线粒体嵴和线粒体膜被破坏，内质网呈不规则密集团状，小泡和高尔基体消失，模型组的情况较rHuEPO组更严重，见图1。

2.3 各组大鼠肝功能指标比较 假手术组血清ALT、AST水平低于rHuEPO组和模型组，rHuEPO组低于模型组，差异有统计学意义(P＞0.05)；随着再灌注时间的推移，模型组和rHuEPO组血清ALT、AST水平均显著增高，再灌注3 h组高于再灌注1 h组，再灌注6 h组高于再灌注3 h组，差异有统计学意义(P＜0.05)；假手术组的不同亚组血清ALT、AST水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较(±s，U/L)

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较(±s，U/L)

注：与再灌注1 h比较，a P＜0.05；与再灌注3 h比较，b P＜0.05；与假手术组比较，c P＜00.05；与模型组比较，d P＜0.05。

组别 只数ALT AST假手术组模型组rHuEPO组F值P值30 30 30再灌注1 h 137.23±24.76 493.27±57.83c 278.33±44.29cd 22.783＜0.05再灌注3 h 139.83±25.87 805.29±68.92ac 425.71±48.99acd 26.485＜0.05再灌注6 h 135.52±26.13 1185.44±82.59abc 621.57±55.76abcd 31.296＜0.05再灌注1 h 180.25±33.28 689.75±66.57c 392.54±41.36cd 27.414＜0.05再灌注3 h 175.16±34.27 987.36±89.49ac 502.78±49.63acd 31.085＜0.05再灌注6 h 178.26±34.82 1328.53±95.27abc 711.44±56.59abcd 33.496＜0.05

2.4 各组大鼠炎症因子指标比较 假手术组血浆TNF-α、IL-1水平低于rHuEPO组和模型组，rHuEPO组低于模型组，差异有统计学意义(P＞0.05)；随着再灌注时间的推移，模型组和rHuEPO组血浆TNF-α、IL-1水平均显著增高，再灌注3 h组高于再灌注1 h组，再灌注6 h组高于再灌注3 h组，差异有统计学意义(P＜0.05)；假手术组的不同亚组血浆TNF-α、IL-1水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 各组大鼠血浆TNF-α、IL-1水平比较(±s，ng/L)

表3 各组大鼠血浆TNF-α、IL-1水平比较(±s，ng/L)

注：与再灌注1 h比较，a P＜0.05；与再灌注3 h比较，b P＜0.05；与假手术组比较，c P＜0.05；与模型组比较，d P＜0.05。

组别 只数TNF-α IL-1假手术组模型组rHuEPO组F值P值30 30 30再灌注1 h 17.36±2.24 24.15±3.83c 19.28±2.76cd 6.572＜0.05再灌注3 h 21.59±2.36 185.47±22.38ac 104.29±17.68acd 24.279＜0.05再灌注6 h 20.33±2.13 297.56±41.57abc 198.36±31.22abcd 27.648＜0.05再灌注1 h 25.66±2.87 36.48±2.95c 30.17±3.05cd 8.472＜0.05再灌注3 h 26.82±2.91 202.57±28.53ac 126.39±20.63acd 26.574＜0.05再灌注6 h 27.05±2.89 392.64±44.52abc 201.85±26.47abcd 39.667＜0.05

2.5 各组大鼠氧化应激指标比较 假手术组肝组织SOD水平高于rHuEPO组和模型组，rHuEPO组高于模型组，差异有统计学意义(P＞0.05)；假手术组肝组织MDA水平低于模型度和rHuEPO组，rHuEPO组低于模型组，差异有统计学意义(P＞0.05)；随着再灌注时间的推移，模型组和rHuEPO组组织SOD水平均显著降低，MDA水平显著升高，再灌注3 h组与再灌注1 h组比较，再灌注6 h组与再灌注3 h组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；假手术组的不同亚组肝组织SOD、MDA水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 各组大鼠肝组织SOD、MDA水平比较(±s，U/mg)

表4 各组大鼠肝组织SOD、MDA水平比较(±s，U/mg)

注：与再灌注1 h比较，a P＜0.05；与再灌注3 h比较，b P＜0.05；与假手术组比较，c P＜0.05；与模型组比较，d P＜0.05。

组别 只数SOD MDA假手术组模型组rHuEPO组F值P值30 30 30再灌注1 h 113.28±9.67 51.25±6.34c 82.58±7.42cd 15.784＜0.05再灌注3 h 115.07±9.72 42.36±6.14ac 70.06±6.95acd 19.376＜0.05再灌注6 h 114.36±9.52 36.18±5.92abc 67.43±6.71abcd 21.494＜0.05再灌注1 h 5.12±0.67 14.81±2.23c 7.36±1.12cd 4.713 0.002再灌注3 h 4.83±0.61 21.36±1.85ac 14.39±1.39acd 9.782＜0.05再灌注6 h 4.80±0.44 28.46±1.49abc 20.51±1.83abcd 11.525＜0.05

3 讨论

HIRI多见于需要阻断肝脏血流的外科手术，其发生机制主要包括代谢性酸中毒、氧自由基增多、中性粒细胞表达上调、钙超载、及细胞因子表达异常等[6-7]。一般情况下，HIRI是术后肝功能异常、原发性移植肝无功能、肝功能衰竭的重要原因。因此，如何有效预防HIRI是手术成功的关键环节之一。目前尚无治疗HIRI的有效方法，有研究表明，通过再灌注前给药及缺血预处理可不同程度减轻肝损伤程度[8-9]。脂肪肝对HIRI更敏感，术后发生肝功能衰竭的风险更大[10]。rHuEPO的主要成分是促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)，目前临床上主要用于治疗贫血，其刺激骨髓生成红细胞以及对心肌、脑、肾脏缺血再灌注损伤的保护作用已被广大学者的研究予证实[11-12]。rHuEPO对脂肪肝缺血再灌注损伤后肝细胞凋亡及炎症因子的影响及机制目前尚不明确。

本研究显示，相对于假手术组而言，模型组和rHuEPO组均存在肝细胞组织结构及肝细胞超微结构改变，而模型组改变情况较rHuEPO组更严重，说明HIRI后存在肝细胞组织结构改变，而rHuEPO预处理能一定程度抑制这种改变，从而发挥了保护肝功能的作用。模型组各亚组肝细胞凋亡指数高于rHuEPO组和假手术组相同时相的各亚组，说明HIRI后存在肝细胞凋亡情况，通过rHuEPO预处理能较大程度抑制肝细胞凋亡，可以作为提高脂肪肝手术安全性和改善预后的方案之一。ALT和AST是肝功能检查的两项常用指标，当肝脏受损时，可引起ALT和AST水平升高[13-14]。本研究显示，假手术组各亚组血清ALT、AST水平低于rHuEPO组和模型组相同时相的各亚组，rHuEPO组各时相亚组均低于模型组相同时相的各亚组，说明HIRI后存在肝功能损伤，而通过rHuEPO预处理可一定程度上保护肝功能。rHuEPO对脂肪肝HIRI后肝功能的保护作用机制尚不清楚，有研究显示，rHuEPO不能直接促进抗凋亡信号通路和诱导B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bul-2)信使RNA表达，rHuEPO对HIRI后肝脏的保护作用不是直接作用于肝细胞，可能通过其他机制发挥作用[15-16]。

过度炎症反应是缺血再灌注后肝损伤的主要机制之一，抑制缺血再灌注过程中的炎症反应可减轻肝脏损伤[17-18]。TNF-α、IL-1是两种重要的炎症因子，通过促进白细胞局部聚集与活化、诱导黏附分子及趋化因子表达等多种途径介导炎症反应，其表达水平上调可增大缺血再灌注损伤程度。本研究显示，假手术组各亚组血浆TNF-α、IL-1水平低于rHuEPO组和模型组相同时相的各亚组，rHuEPO组各时相亚组均低于模型组相同时相的各亚组，说明HIRI后存在过度炎症反应情况，rHuEPO预处理可一定程度抑制脂肪肝缺血再灌注过程中的炎症反应。SOD是体内重要的氧化酶，肝脏缺血再灌注是其活性降低；MDA是机体脂质过氧化反应的主要产物，其水平反映了氧化应激损伤程度[19]。本研究显示，假手术组各亚组肝组织SOD水平高于rHuEPO组和模型组相同时相的各亚组，rHuEPO组各亚组高于模型组相同时相的各亚组；假手术组各亚组肝组织MDA水平低于模型度和rHuEPO组相同时相的各亚组，rHuEPO组各亚组低于模型组相同时相的各亚组，肝脏缺血再灌注过程存在过度氧化应激反应，rHuEPO预处理可一定程度抑制氧化应激反应。

综上所述，rHuEPO可能通过抑制大鼠脂肪肝缺血—灌注过程中的炎症反应和氧化应激反应发挥对肝功能的保护作用，能一定程度抑制肝细胞凋亡。