SRAP技术在榆林市榆阳区南部山区杏树品种测定中的应用

周飞梅，罗怀峰，朱建军，常海涛

(1.陕西省榆林市榆阳区林业工作站，陕西 榆林 719000；2.榆林市榆阳区鱼河林场，陕西 榆林 719000)

杏树属于蔷薇科杏属(Armenica)植物[1,2]，是我国十分重要的经济树种，目前已知的品种类型有1400多种，该树种的果肉营养丰富，味美甘甜，果仁不仅营养价值高，还可入药，是我国传统的出口物资[3]。我国是杏树的起源中心，该树种耐寒，耐旱，相对于其他果树，适应力强，因此其多栽培在气候寒冷地区，是我国北方地区特别是华北、东北、黄河流域重要的经济生态树种。SRAP分子标记技术是利用正反引物直接检测基因的可阅读框 ORFs区域，在未知基因组序列的情况下对基因的编码区进行 PCR 扩增，从而定向分析基因。该技术能有效地克服RAPD 、SSR等常规分子标记技术中成本高、操作复杂、稳定性差等缺点，具有操作简便、高共显性、在基因组中分布均匀等优势。该技术在植物基因组学研究上的运用极大弥补和丰富了分子标记技术。本研究通过SRAP 分子标记法从基因型方面对21个杏树品种进行系统的遗传多样性分析，从分子水平上揭示榆林市榆阳区南部山区不同杏树品种之间遗传差异，探讨其亲缘关系，为后期杏树育种、基因定位等研究工作提供可靠的科学依据。

1 试验材料

1.1 供试材料

供试的杏树共21个品种，来自陕西省榆林市榆阳区南部山区(见表1)。

表1 榆阳区杏树新品种选育标准株对比表

1.2 SRAP引物

以14优一、15大龙王帽、16山杏、20一窝峰为试验材料筛选引物，从132对引物中筛选了16对引物，其中包括11对正引物，12对反引物,并委托苏州泓迅生物科技有限公司合成(见表2)。

表2 SRAP 引物序列信息

1.3 主要试剂

1.0 M Tris-HCl(pH8.0)250 mL ；Tris30.3 g；无菌水200 mL ；HCl 16 mL ；0.5 M EDTA (pH8.0)250 mL；50 x TAE(p H 8.0)500 mL；TE 缓冲液(pH 8.0)500 mL；LB 培养基。

2 试验方法

2.1 扩增反应总体系

参考彭飒[4]等报道，PCR反应体系为20 μL：10 μL 2× TaqMasterMix (CWBIO Biotechnology Beijing Co.,Ltd.,China);引物各1.0 μL,1 μL 模板DNA，7 μL双蒸水。扩增反应程序参考 Li和Quiros[5]的标准SRAP-PCR：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，35 ℃复性 1 min，72 ℃延伸1.5 min，循环5次；94 ℃变性1 min，49 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，循环35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃永久保存。

2.2 多态性引物筛选

利用132个引物组合对21个杏树栽培品种进行扩增，根据图谱统计扩增得到每个引物的多态性条带数，对其进行多态性分析，并进行21个品种的聚类分析。

2.3 数据统计方法

用NTSYS-PC软件中的SIMQUAL程序计算Jaccard遗传相似性系数(SG)，并获得遗传相似系数矩阵。计算公式：SGij= 2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij指2个个体间共有的带数，Ni+Nj指2个个体所有带数之和。用NTSYS-PC软件中的SAHN程序和UPGMA(unweighted pair group mean average)方法进行聚类分析，并通过Treeplot模块生成系统树图。

3 结果与分析

3.1 电泳结果

根据本次试验共21个供试品种，有6对引物得到清晰的谱带，可供分析用。

3.2 聚类分析

根据 PCR 扩增结果，得出供试材料遗传多样性聚类图3。结果表明，21份供试材料间的遗传相似性系数值变化范围为0.32～0.93。其中材料1与16之间的遗传。相似系数最小,为0.32。这表明两种源地材料的亲缘关系相对较远;而材料8与9遗传相似系数最大,达到0.90。说明它们之间的亲缘关系最近。UPGMA聚类分析结果显示,见图所示,当SG值在0.65水平上可将供试材料聚为3类，其中供试材料1为第Ⅰ类，供试材料7，16，17，19，20为第Ⅱ类，剩下的供试材料为第Ⅲ类。

4 讨论与结论

从图3聚类分析结果来看，21个供试材料可分为三个类群。从杏树所处的地理位置上分析，杏树因在其特有的气候条件下的长期栽培，而对周围环境产生的适应性，使得杏树其种质基因组相对稳定、独立，因此利用SRAP 对杏树基因组进行随机性的PCR扩增，可获得大量的多态性条带，这些条带来自于杏树的基因组外显子、内含子、启动子区域，而这些区域的多态性能够准确、真实地反应出杏树的种质基因组特点。

根据聚类分析结果，第Ⅰ类中的供试材料1号为田园选中火红品种，其遗传特性非常奇特，该供试材料株高明显高于其他供试材料；而第Ⅱ类中的7，16，17，19，20号多为优一品种，它们之间的遗传相似系数极高，系数区间为0.682%～93%，说明他们亲缘关系较近，与所选母树的遗传性状较一致，具有较大的研究价值，可进一步在大田中观察研究，对其独特性进行发掘。其余供试材料间遗传距离相当，可作为对照品种进行观察研究。