紧密连接蛋白Claudin6 表达与乳腺癌组织临床指标的关系

李雪松，王立平通讯作者，李鸿梅，刘春忻，冷晓宁，谭佳音

（齐齐哈尔医学院 病理学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

0 引言

乳腺癌是来自乳腺终末导管小叶单元上皮的恶性肿瘤，肿瘤在发生过程中乳腺上皮细胞可获得间质特性，失去典型的上皮细胞黏附性以及极性，从而获得一定迁移能力，诱使肿瘤细胞离开原发部位通过血管和淋巴管向远处转移[1]。乳腺癌的发病率居我国女性癌症发病率第一位也是影响女性健康最常见的恶性肿瘤之一[2]。有研究显示，肿瘤组织紧密连接结构和功能的异常，使其蛋白复合体或单个组分可能成为肿瘤检测，治疗和预后的新靶标[3]。又有研究表明，Claudins蛋白可能在多种肿瘤的发生，浸润及转移中发挥重要作用[4]。Claudin6作为Claudins蛋白家族的27个成员之一[5]。Claudins家族不同成员在不同肿瘤中表达各异，所代表的生物学意义也不同。本实验通过免疫组化的方法分析Claudins在乳腺癌组织中的表达与乳腺癌组织病理分级、临床分期、淋巴结转移及年龄等临床指标的关系，为后续研究Claudin6在乳腺癌发生发展及转移过程中可能起到的作用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料。收集2018年8月至2019年7月齐齐哈尔医学院病理诊断中心标本，其中乳腺癌组织78例和对应的癌旁正常组织44例。患者术前均未经任何抗癌治疗。乳腺癌组织标本均为女性，其中有淋巴结转移者32例，无转移者46例。按临床分期Ⅰ期和Ⅱ期48例、Ⅲ期和Ⅳ期30例。按三级分级法进行病理分级，Ⅰ级24例、Ⅱ级42例、Ⅲ级12例。患者年龄22-78岁，平均47.8岁。所有标本均与切除后30 min内放入10%中性缓冲福尔马林常温固定后脱水包埋，制成蜡块，切片制成4 μm。

1.2 主要仪器和试剂。光学显微镜，电热恒温培养箱，Claudin6山羊抗人多克隆抗体，SP免疫组化试剂盒。

1.3 免疫组织化学染色。采用免疫组织化学SP法对78例乳腺癌组织的Claudin6进行了检测，检测Claudin6在乳腺癌组织中的表达。具体方法：蜡块，切片制成4μm，脱蜡水化；抗原修复；滴加3%H2O2；滴加即用型正常山羊血清，滴加0.01MPBS稀释的一抗（1：100PBS稀释羊抗人Claudin6多克隆抗体）；滴加生物素标记的二抗；滴加链霉素亲生物素-过氧化物酶溶液，；滴加DAB显色剂，显微镜下观察显色；自来水冲洗，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗做阴性对照。

1.4 免疫组化结果判定。Claudin6阳性表达判定标准，细胞膜与细胞浆同时出现棕黄色着色为阳性，细胞无着色或单纯细胞浆着色、细胞膜着色为阴性。本实验采用着色细胞计数法进行判定，选择染色良好区域，任意计数5个高倍视野下的阳性细胞数，然后取平均值，着色细胞数＜5%为阴性，着色细胞数≥5%为阳性。

1.5 统计学处理。所有数据均使用SPSS 22.0统计软件进行统计处理，P＜0.05两者差异有显著性，具有统计意义。

2 结果

2.1 Claudin6在乳腺癌组织中的表达与病理分级的关系。Claudin6在乳腺癌病理分级Ⅰ级中阳性表达率为79.17%，在乳腺癌病理分级Ⅱ级中阳性表达率为64.29%在乳腺癌病理分级Ⅲ级中阳性表达率为66.67%。Claudin6表达与病理分级无关（P＞0.05），结果见表1。

2.2 Claudin6在乳腺癌组织中的表达与临床分期的关系。Claudin6在乳腺癌临床Ⅰ-Ⅱ期中阳性表达率为68.75%），Ⅲ-Ⅳ期阳性表达率为70.00%，两者差异无显著性（P＞0.05），结果见表1。

2.3 Claudin6在乳腺癌组织中的表达与淋巴结转移的关系。78例乳腺癌患者中，病理检查有淋巴结转移者32人，Claudin6表达阳性者22人，阳性表达率为68.75%，无淋巴结转移者46人，Claudin6表达阳性者34人，阳性表达率为73.91%。经统计学分析，Claudin6表达与淋巴结转移无关（P＞0.05），结果见表1。

2.4 Claudin6在乳腺癌组织中的表达与年龄的关系。78例乳腺癌患者按年龄分22-50岁组和51-78岁组，22-50岁组阳性表达率为57.78%，51-78岁组Claudin6表达率为81.82%，两者差异无显著性（P＞0.05），结果见表1。

表1 Claudin6在乳腺癌组织中的表达与临床指数的关系（n，%）

3 讨论

本研究采用免疫组化SP法，对78例乳腺癌组织进行Claudin6表达的检测，通过分析其表达与临床分期、病理分级及淋巴结转移以及年龄等临床指标的关系。结果表明，Claudin6的表达与乳腺癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移及年龄无关。但在本实验中，乳腺癌组织claudin6表达低于癌旁正常组织，有淋巴结转移的乳腺癌组织Claudin6的表达低于无淋巴结转移的乳腺癌组织，虽无统计意义，但还能在一定程度上说明在Claudin6表达下调或许在乳腺癌发生发展中起一定的作用。因此可以认为，乳腺癌上皮组织中Claudin6表达下调可引起紧密连接结构和功能的异常，从而导致细胞黏附性降低、运动性和侵袭性增加，并通过激活基质金属蛋白酶等途径，促进了乳腺癌转移的发生。也为后续探讨Claudin6在乳腺癌的发生、侵袭和转移中的作用以及临床上的应用提供一定的理论依据。