荧光免疫层析法与试管凝集试验检测布鲁氏菌病抗体的分析比较

高树朋 张明飞 张贺森 高永士

（1.阜阳市动物疫病预防与控制中心，安徽阜阳 236000；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川成都 610000）

布鲁氏菌病（brucellosis）简称布病，是由布鲁氏杆菌属细菌引起牛、羊、猪、鹿、犬等哺乳动物和人类共患的一种传染病。布鲁氏菌属分6个种19个型，即羊种布鲁氏杆菌（3个型）、牛种布鲁氏杆菌（8个型）、猪种布鲁氏杆菌（5个型）、绵羊附睾种布鲁氏杆菌（1个型）、沙漠森林野鼠种布鲁氏杆菌（1个型）和狗种布鲁氏杆菌（1个型）。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病，流行的主要是羊、牛、猪三种布鲁氏菌病，其中以羊布鲁氏菌病最为多见，其次是牛布鲁氏菌病。近年来，随着我国家畜饲养量不断增加，动物及其产品流通频繁，部分地区布鲁氏菌病等人畜共患病呈持续上升势头，不仅严重影响畜牧业生产，也严重危及人民身体健康和公共卫生安全。

根据《国家布鲁氏菌病防治计划》（2016-2020年）要求，安徽省作为二类地区采取以监测净化为主的防控策略，亟需开展家畜布鲁氏菌病抗体监测。实验室一般依据《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646-2018）标准，通常采用“虎红平板凝集试验和试管凝集试验”开展家畜布鲁氏菌病诊断检测。随着荧光免疫层析技术发展，广泛应用于动物疫病诊断检测方面。现就“荧光免疫层析法”与试管凝集试验进行分析比较。

1 样品来源

2018年承担实施全省牛羊布鲁氏菌病监测净化项目，开展奶牛、种羊监测全覆盖，其他牛羊按比例抽样监测。全年合计监测22451份血清（包括第一次抽样监测10421份，第二次抽样监测12030份）。考虑检测成本，所有样品经虎红平板凝集试验初筛，阳性血清351份（其中第一次抽样中134份，第二次抽样中217份），开展试管凝集试验和荧光免疫层析法检测分析比较。

2 试验材料

2.1 试管凝集试验

抗原（5ml/瓶）、阳性血清（1ml/瓶）、阴性血清（2ml/瓶），恒温培养箱、离心机，其他试剂及试验耗材。

2.2 高敏荧光免疫层析法

高敏荧光分析仪配套检测箱、布鲁氏杆菌抗体定量检测试剂卡（采用荧光免疫层析技术），试验耗材。

3 试验方法

3.1 试管凝集试验

步骤参照《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646）执行，需倍比稀释并置37～40℃温育24h。

3.2 荧光免疫层析法

3.2.1 准备：①试剂卡与被检样本复温；②按荧光仪电源键（灯亮）；③启动手机微瑞云检测APP；④扫描试剂盒上的二维码，在线获取标准曲线；⑤建立工作目录，选择标准曲线；⑥按待测样本在EP管上做好标识；

3.2.2 稀释：10倍稀释。即每支稀释管中先加入180μl稀释液，再加被检样本20μl，混匀待检；

3.2.3 加样：取80μl稀释混匀待检样本，按对应编号依次有序加入试剂卡加样孔中；

3.2.4 检测：静置15min（注意避光），将检测卡放入高敏荧光仪完成“检测”操作，显示检测结果。在确保依次加样和依次检测的时间间隔一致时，只需第一份加样后等待15min，然后进行连续检测。

4 试验结果

（1）通过虎红平板凝集试验初筛阳性血清351份，经试管凝集试验检测结果详见表1，判定其中339份为阳性，6份为阴性，6份为可疑。

表1

（2）通过荧光免疫层析法检测（虎红平板凝集试验初筛阳性血清351份）结果详见表2，判定其中335份为阳性，12份为阴性，4份可疑。

表2

结果判定标准为布病抗体效价（1～1600效价）。效价＞50为阳性，代表保护抗体有保护或被布鲁氏杆菌感染；效价＜25以下为阴性，代表保护抗体不保护或尚未被布鲁氏杆菌感染；效价25～50之间为可疑，需30天后采血重检，如果仍为可疑，判为阳性。

（3）荧光免疫层析法与试管凝集试验的阳性检出率详见表3，阳性检出率差值1.2%（其中第一次阳性检出率差值0，第二次阳性检出率差值1.9%）。荧光免疫层析法与试管凝集试验的检出率符合度为335/339*100%=98.8%（其中第一次132/132*100%=100%，第二次203/207*100%=98.1%）。

5 分析讨论

5.1 试验时间要求

按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646），对虎红平板凝集试验初筛阳性样本进一步开展试管凝集试验核查。该试验耗时较长，除操作步骤外，需置37～40℃温育24h，方可观察结果；荧光免疫层析法在确保依次加样和依次检测的时间间隔一致时，只需第一份加样后等待15min，然后进行连续检测，实现高通量检测。

5.2 实验人员要求

布病试管凝集试验操作复杂，需要专业技术人员开展，结果判定需肉眼对比观察，需具备一定试验经验；荧光免疫层析法操作简便，采用手机操控高敏荧光分析仪检测、云计算，人为因素影响小，灵敏度高。

5.3 试验条件要求

布病试管凝集试验必须在实验室内进行，需具备实验台、培养箱等仪器设备及化学试剂、耗材等；荧光免疫层析法所用仪器设备、耗材等均放置便携式检测箱，更适于基层畜牧兽医部门和养殖场户现场开展检测。

表3

5.4 实验结果分析

两种试验方法检测布鲁氏菌病抗体阳性检出率符合度达98.8%，说明荧光免疫层析法适用于布鲁氏菌病抗体检测，结果科学准确。布病试管凝集试验仅对被检样品进行阴、阳性的定性判定，无法进行定量计算；荧光免疫层析法直接对被检样品进行定量计算，通过手机自动显示、保存，实现即时布鲁氏菌抗体定量精准检测。