无细菌松材线虫对马尾松的致病性*

朱丽华 章欣月 夏馨蕊 万 羽 代善俊 叶建仁

(南方现代林业协同创新中心 江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室 南京林业大学林学院 南京 210037)

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)病又称松树萎蔫病,是松属(Pinus)树种的一种毁灭性病害，不仅在世界范围内造成高达数千万美元的损失(Tóth, 2011)，而且导致严重的生态破坏。1905年，日本首次报道大面积松树萎蔫枯死，随后病害迅速扩展蔓延，几乎席卷日本全境。20世纪80年代，该病害相继传入中国(程瑚瑞等，1983)和韩国(Choietal., 1989; Moonetal., 1995)。随后，松材线虫病传入葡萄牙(Motaetal.， 1999)和西班牙(Abelleiraetal.， 2011)，成为一种世界性松树病害。我国于1982年首次发现松材线虫病，30多年来，该病害迅速扩散到南方多个省(区)，并逐步向北方省份蔓延。截止2018年，我国松材线虫病疫区涉及18个省(区、市)的588个县级行政区(叶建仁， 2019)，与2018年相比，2019年新增松材线虫病疫区283个，病害防控形势异常严峻。在我国，该病害主要为害马尾松(Pinusmassoniana)、黑松(P.thunbergii)、赤松(P.densiflora)等松属树种， 2018年，首次发现我国东北地区广泛种植的落叶松(Larix)感染该病害(于海英等， 2019)。

松材线虫病的发生发展涉及多个生物因子(Rorizetal.， 2011)，其病原目前尚存在一定争议，致病机制迄今尚不明确(Proençaetal., 2010)，这给防控工作带来了极大困难(杨宝君， 2002)。多数学者认为松材线虫是该病害的唯一病原(Nickleetal.， 1981； 杨宝君， 2002； 叶建仁等， 2012)，而有些学者认为，松材线虫病由松材线虫携带的产毒细菌引起(Okuetal.， 1980； Kawazuetal.， 1997； 郭道森等， 2000； Hanetal., 2003)。有研究表明，无菌松材线虫并未失去对松苗的致病性(Zhuetal., 2012； Zhaoetal.， 2013； 林丽等， 2017)； 而有些研究显示，松树萎蔫与松材线虫携带细菌有关，无菌松材线虫丧失了致病性(Kawazuetal.， 1997； Kawazuetal.， 1999; Hanetal., 2003)，有研究者提出松材线虫病是松材线虫及其伴生细菌复合侵染引起(郭道森等， 2000； 赵博光， 2004)。由于病原问题不十分明确，防控措施中既有针对松材线虫的树干注射(叶建仁，2019)，亦有针对松材线虫携带细菌的抗生素法(Kwonetal.， 2010)和细菌演替法(姚伍等，2018)。本研究以马尾松5年生盆栽苗为试验材料，探讨了无菌松材线虫的致病性，旨在进一步探明松材线虫病的病原，为疫情控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试虫株为强致病力松材线虫虫株AMA3的近交系后代AMA3c1(本文称带菌松材线虫)，使用前培养于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上。无细菌松材线虫(本文称无菌松材线虫，代号BFAMA3c1)的制备及无菌检验参照朱丽华等(2011)的方法，经检验无任何细菌生长，用于接种试验。

5年生马尾松盆栽苗培养于南京林业大学，备用。

1.2 无菌松材线虫对温室马尾松盆栽苗的致病性测定

松材线虫致病性测定采用人工皮接法(张治宇等， 2002)。首先，用70%酒精棉球擦拭当年生枝条基部待接种部位，再用无菌手术刀斜切一个约1 cm长的伤口，伤口深达木质部。立即于伤口处塞入1无菌棉球，用无菌枪头将0.4 mL带菌松材线虫和无菌松材线虫悬液(8 000条)分别接种于伤口处无菌棉球上，用封口膜轻轻包裹固定，达到保湿效果，以等体积无菌水为对照，每处理各接种20株马尾松。接种后，于28 ℃温室条件下培养。

1.2.1 萎蔫状况观察 每2天观察1次，记录松苗发病和萎蔫的情况，统计松苗萎蔫率，即萎蔫率=萎蔫植株数/接种植株数×100%。

1.2.2 松脂分泌状况观察 在接种5、10、30天后对植株分别取样，每组取3株作为重复。选取接种点下2 cm处茎段，去除针叶，切出平整截面，观察松脂分泌情况。

1.2.3 组织病理学结构观察 取接种20天后接种点上方2 cm处茎段，按照周乃富等(2018)的方法制作石蜡切片，每组取样3次作为重复。取下的茎段立即放入FAA固定液，浸泡24 h以上，软化剂浸泡7天以上，乙醇和二甲苯脱水处理，浸蜡，包埋，切片，番红固绿染色，封片。光学显微镜下观察茎段横截面的组织结构。

1.2.4 线虫种群增长情况 在接种后30天，对植株分别取样，进行线虫的再分离，每组取3个重复。取接种部位上下10 cm茎段(共20 cm)，去除针叶，修剪成5～6 mm的小段，采用贝尔曼漏斗法再分离线虫，静置24 h后收集线虫悬液，离心去上清液后保留约1 mL，统计线虫数量。将试样置于85 ℃热烘3天至恒质量称量。计算每克木样中线虫数量。

1.3 数据统计与分析

采用GraphPadPrism6.01软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 无菌松材线虫和带菌松材线虫接种马尾松外观症状变化

无菌松材线虫及带菌松材线虫接种均可导致马尾松萎蔫，且外观症状与野外发病症状一致(图1A、B)。无菌松材线虫和带菌松材线虫接种的马尾松均于接种5天后出现发病症状，发病率分别于第8天和第12天达到50%。2组松材线虫接种发病症状均表现为接种5天后针叶失去光泽，轻微褪绿； 10天后，针叶明显黄化，部分针叶下垂； 20天后，针叶全部下垂； 30天后针叶转为红褐色，整株枯萎(图1A)。接种35天后，无菌松材线虫及带菌松材线虫致萎蔫率均达到90%，对照组马尾松始终保持健康(图1B)。

图1 5年生马尾松盆栽苗接种无菌松材线虫和带菌松材线虫后的外观症状Fig.1 Symptoms of 5-year-old potted Pinus massoniana after inoculation with aseptic and non-aseptic pine wood nematodesA. 接种5、10、20和30天后马尾松外观症状变化 Symptoms of P. massoniana at 5 d, 10 d, 20 d and 30 d after inoculation, respectively； B. 接种35天后马尾松外观症状Symptoms of P. massoniana 35 days after inoculation.比例尺Scale bar=10 cm

2.2 无菌松材线虫和带菌松材线虫接种马尾松松脂分泌情况

无菌松材线虫及带菌松材线虫接种均导致马尾松树脂分泌失常。接种带菌线虫的马尾松在接种5天后尚分泌少量松脂，10天后几乎停止分泌松脂，30天后开始出现空洞。无菌松材线虫接种的马尾松，5天后几乎停止分泌松脂，10天后茎段出现少量空洞，30天时出现大片空洞。对照组马尾松正常分泌树脂，茎段横切面完整平滑(图2)。

2.3 无菌松材线虫和带菌松材线虫接种马尾松组织病理学结构

石蜡切片结果显示，对照马尾松皮层薄壁细胞轮廓近椭圆形，细胞壁完整，被染成绿色，内有明显细胞质； 树脂道椭圆形，围绕树脂道的上皮细胞形态规整(图3A)。木质部细胞细胞壁完整，排列紧密，被染成紫红色； 树脂道周围的上皮细胞细胞壁完整(图3B)。髓心细胞清晰完整，界限明显； 细胞质淡薄，被染成绿色(图3C)。

接种带菌松材线虫的马尾松皮层细胞在线虫影响下多变形或残缺，细胞壁破裂不连续，细胞质极少； 树脂道变形，围绕树脂道的上皮细胞破损(图3D)。木质部细胞细胞壁多完整，排列紧密，有少数微小空隙； 薄壁细胞、射线细胞被破坏，树脂道周围上皮细胞细胞壁破碎或成不规则形状(图3E)。髓心细胞轮廓较完整，细胞质浓厚并皱缩变形，被染成深红色，部分细胞核变形或破裂(图3F)。

接种无菌松材线虫的马尾松皮层细胞呈扁的不规则形状，细胞壁被线虫破坏而变得零碎，细胞核和细胞质大多消失，树脂道周围上皮细胞破损(图3G)。木质部细胞大多完整，部分细胞之间形成空洞，部分树脂道被破坏，周围上皮细胞变形或破裂(图3H)。髓心大面积空洞，与木质部连接处树脂道及其周围细胞破坏严重，髓心细胞少数变形或破裂(图3I)。

图2 无菌松材线虫和带菌松材线虫接种后马尾松的松脂分泌情况Fig.2 Secretion of resin of P. massoniana after inoculation with aseptic and non-aseptic pine wood nematodes箭头所示为松脂，三角形所示为空隙The arrows point at pine resins and the triangles point at cavities.

图3 无菌松材线虫和带菌松材线虫接种20天后马尾松茎段横切面显微结构Fig.3 Anatomical of stem cross sections of P. massoniana after inoculated with aseptic and non-aseptic pine wood nematodes for 20 daysRc: 树脂道Resin canal； R: 射线Ray； P: 髓心Pith.

2.4 无菌松材线虫和带菌松材线虫接种马尾松体内线虫种群数量

接种后第30天，线虫再分离结果显示，无菌松材线虫和带菌松材线虫接种致萎蔫马尾松苗中均能再分离得到大量松材线虫，无菌松材线虫接种致萎蔫植株中再分离线虫数量高于带菌松材线虫接种致萎蔫植株，其再分离线虫数量分别为(8 167±5 840)条·g-1和(4 475±2 138)条·g-1，但二者差异不显著(P=0.361 9)。

3 讨论

探明松材线虫病真正的病原，是该病害致病机制研究和防治的基本问题。诸多研究者对该病害的病原进行了研究，但松材线虫及其伴生细菌在松树萎蔫中的作用依然未能达成共识。

本研究中，无菌松材线虫和带菌松材线虫接种均可引起马尾松苗发病，发病植株外观症状与野外自然发病症状相似； 2组线虫处理均导致马尾松松脂分泌异常，最终停止分泌； 2组线虫对马尾松的致病力相似，致松苗萎蔫率均达到90%； 从无菌松材线虫和带菌松材线虫处理致萎蔫的植株体内均能再分离得到松材线虫，接种无菌线虫植株中再分离到的线虫数量稍高于带菌线虫接种植株，但二者差异不显著，证明松材线虫能单独引起松树萎蔫，该结果与Tamura(1977，1983)、Zhu等(2012)、Zhao等(2013)、Faria 等(2015)、林丽等(2017)、Rodrigues 等(2017)等的结果一致，而与Kawazu等(1997； 1999)、洪英娣等(2002)、Han 等(2003)以及王华光等(2018)等的结果相反。Tamura(1977)发现无菌松材线虫及带菌松材线虫接种均可使3年生赤松苗萎蔫，且二者致松苗枯死率无差别； 并且，在石蜡油中保存1年后，无菌松材线虫依然保持其致病性。Tamura(1983)进一步证实无菌松材线虫接种不仅能使无菌黑松苗萎蔫，同样能使温室盆栽的3年生赤松苗萎蔫。多位研究者采用无菌松材线虫在完全无菌条件下对马尾松(Zhuetal. 2012)、赤松(Zhuetal.， 2012，林丽等， 2017)和海岸松(Pinuspinaster)(Fariaetal.， 2015)组培苗或松树愈伤组织(林丽等， 2017)进行接种，发现能导致松苗萎蔫、愈伤组织严重水渍化并失去活性。Zhao等(2013)证实无菌松材线虫能使7～8年生黑松萎蔫。Rodrigues 等(2017)亦发现无菌松材线虫及带菌松材线虫接种的2年生地中海松(P.halepensis)，其萎蔫症状及化学成分变化均无差别。然而，Kawazu等(1997； 1999)的结果表明，无菌化处理使松材线虫OKD-3虫株失去了对赤松无菌苗的致病性； 洪英娣等(2002)和Han等(2003)亦报道无菌松材线虫单独接种不能使黑松无菌苗萎蔫； 王华光等(2018)发现无菌松材线虫对3年生黑松没有致病性。这其间的差异可能与试验所用的虫株有关，也可能与致病性测定所用接种方法及观察时间有关。例如，Kawazu 等(1997； 1999)对1月龄赤松无菌苗进行接种时，将无菌苗长15 mm的针叶剪去13 mm，然后用淀粉糊将棉球固定在剩余叶子的顶部，再在棉球上接种线虫悬浮液； 洪英娣等(2002)对试管中2月龄黑松无菌苗进行接种时，用针于无菌苗茎干中上部轻轻刺一伤口，附上少许灭菌脱脂棉后接种线虫液于脱脂棉上，接种4天后统计萎蔫率，5天后拔出松苗进行线虫再分离。虽然Kawazu 等(1997)无菌条件下的接种结果显示无菌OKD-3失去致病性，但其开放条件下的接种结果却表明无菌OKD-3依然能导致非无菌赤松苗的枯萎，该结果与Tamura(1977； 1983)的结果一致。对此，Kawazu等(1997)认为，由于在开放条件下接种，无菌松材线虫重新感染了具有致病性的细菌，因此使其重新获得了致病性。因此，为了更准确地评价无菌松材线虫的致病性，今后的试验中，应采用更多虫株、更统一的方法(如苗龄、接种方法、接种量、观察时间)在完全无菌的条件下进行接种。

石蜡切片结果显示，无菌松材线虫和带菌松材线虫接种均导致马尾松组织结构发生显著变化。皮层、木质部、髓心大量细胞细胞壁破裂、细胞变形，树脂道上皮细胞破坏严重，该组织病理学变化与Manabu(1987)、金钢等(2007)、贲爱玲等(2012)采用带菌松材线虫接种后所观察到的现象一致，而与李良(2006)、王华光等(2018)等的结果不同。李良(2006)发现无菌松材线虫处理植株其组织结构与健康植株一致，而伴生细菌或无菌松材线虫与伴生细菌混合接种的黑松，其组织病理学变化与野生松材线虫致死黑松一致。王华光等(2018)亦报道，无菌松材线虫接种黑松的茎段组织超微结构与健康松树无区别，而野生松材线虫、无菌松材线虫与细菌GcM5-1 A或GcM5-1 A鞭毛毒蛋白混合接种可导致黑松组织严重破坏。

4 结论

无菌化处理并未使松材线虫失去对马尾松的致病性，无菌松材线虫与带菌松材线虫一样导致马尾松苗松脂分泌失常，对茎段组织结构造成严重破坏，最终引起松苗萎蔫枯死。因此，松材线虫是引起松树萎蔫病发生的真正原因，其对松树的致病性与其伴生细菌无关。