肺移植术后闭塞性细支气管炎综合征预测标记物研究进展

杨思佳 阿布都买拉木·阿布都吾甫尔 吕望 包飞潮 胡坚

肺移植是治疗慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化、肺囊性纤维化等终末期肺部疾病的有效方法[1]。但是，肺移植患者的长期生存率显著低于其他实体器官移植患者[2]。慢性移植物功能障碍是限制肺移植患者长期生存的主要原因[3]，由于术后闭塞性支气管炎（bronchiolitis obliterans, BO）等并发症的发生，肺移植患者5年生存率约为50%，而10年生存率仅为30%[4]。BO病理表现为间质细胞浸润终末呼吸道并引起纤维增生，闭塞性细支气管炎综合症（bronchiolitis obliterans syndrome, BOS）是BO的临床表述，表现为肺功能进行性不可逆的下降，并排除急性排斥反应，感染或者吻合口并发症等原因[5]。目前，BOS主要的治疗策略是抗炎治疗，缺乏特异性的抗纤维化治疗手段[6]。早期BOS患者可通过干预性治疗延缓BOS的病程进展，因此寻找具有良好相关性、且诊断敏感性较高的指标，有利于BOS的早期诊断和治疗。近年来研究证实，BOS发生发展相关的免疫调节细胞、细胞因子、金属蛋白酶及抑制剂等指标具有不等程度的作为BOS早期诊断标记物的价值。本文就一部分相关研究较多、预测价值相对高的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）和外周血中的生物标记物研究进展进行综述。

1 中性粒细胞（neutrophilia, NE）

NE中性粒细胞在BOS的发生发展过程中发挥着重要作用。气管内NE增多导致成纤维细胞增殖和抗氧化防御枯竭，进而造成气道重塑和纤维化[7]。Neurohr等[8]报道了一项前瞻性研究，检测63例肺移植患者术后3个月-12个月BALF中NE的含量；当NE比例≥20%时，预测BOS的灵敏性为72%，特异性为93%。Verleden等[9]对380例肺移植患者随访发现，发展成BOS的79例患者术后第6、12、18和24个月BALF中NE含量均显著高于正常肺移植患者（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.000,1）。Berastegui等[10]研究证实BOS组的BALF中，NE中位数和INF-γ水平显著高于稳定组，BALFNE可作为预测BOS的标志。目前，已有较多报道[11-15]表明BALF中NE比例可以早期预测BOS的发生。在排除急性排斥反应或淋巴细胞性支气管炎等影响NE含量的干扰因素后，BALF中NE比例升高在预测BOS中的价值已被认可。

2 调节性T细胞

调节性T细胞通过抑制效应性CD4+T细胞和CD8+T细胞的过度活化，在维持移植耐受和控制自身免疫反应中具有重要作用，其含量的异常与BOS的发生密切相关[16]。Bhorade等[17]评估了测定调节性T细胞（T-lymphocytes regulatory,Treg）含量在预测BOS中的价值，通过流式细胞仪比较了14例正常肺移植患者和6例发展为BOS的肺移植患者血液和BALF中T细胞FoxP3的表达水平，发现正常肺移植患者BALF中FoxP3+细胞在CD4+T细胞中所占的比例高于发展成为BOS的肺移植患者；同时发现术后2年内，BALF中CD4+FoxP3+T细胞含量3.2%可作为预测BOS的临界值，而且，FoxP3在CD4+T细胞中的比例不仅可以预测BOS，还能指导肺移植患者免疫抑制治疗。Nakagiri[18]通过随访18例肺移植患者，提出了类似的观点，认为调节性T细胞升高预示着患者术后肺功能良好。Durand等[19]发现，肺移植术后1个月，外周血中CD4+CD25hiFoxP3+T细胞含量2.4%可作为区分BOS患者和稳定患者的界限，移植后6个月CD4+CD25hiFoxP3+T细胞含量2.4%以上的患者患BOS的风险是其他患者的2倍。但也有学者持不同意见，Krustrup等[20]认为组织活检中FoxP3+细胞的密度不能作为预测BOS的指标。

3 CD4+CD28+ T细胞

CD28作为协同刺激分子，与B7家族分子结合产生T细胞活化的共刺激信号在免疫应答的T细胞激活中起重要作用，CD28表达异常与变态反应、慢性免疫疾病、移植耐受等疾病有关。Studer等[21]采用流式细胞术分析肺移植患者外周血CD4+T细胞CD28的表达情况，移植术后6个月内，CD4+CD28+/CD4+T细胞比例低于90%的患者第1秒用力呼气量（forced expiratory volume in the first second,FEV1）下降（0.35±0.04）L，而CD4+CD28+/CD4+T细胞比例高于90%的患者FEV1下降（0.08±0.08）L，两组间有显著性差异（P＜0.013）；且CD4+CD28+/CD4+T细胞比例≤90%时，预测BOS发生的特异性为88%。Hodge等[22]也得出了相似的结果；通过分析58例肺移植患者外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞表达CD28的情况，他们发现正常肺移植患者与发展成BOS的患者外周血中淋巴细胞总数及CD4、CD8在T细胞中百分比无显著差异，而CD4+CD28-/CD4+T细胞、CD8+CD28-/CD8+T细胞比例有显著差异，并且CD8+CD28-/CD8+T与FEV1相关（r=-0.675,P=0.001）。上述研究证实CD4+T细胞和CD8+T细胞低表达CD28可提示移植后较差的肺功能和BOS的发生，对BOS的发生起到预测作用。

4 间充质干细胞

间充质干细胞（mesenchymal stromal cells, MSC）是纤维增殖的初始效应细胞，在组织器官动态平衡、损伤后修复的过程中发挥重要作用[23]。Badri等[24]测定162例肺移植患者术后不同时间点BALF中MSC菌落形成单位（colonyforming units, CFU）的数量，发展成BOS的患者BALF中间充质干细胞CFU数量显著高于正常肺移植患者；研究结果表明移植术后6个月，BALF中间充质干细胞CFU≥10可以预测BOS的发生。MSC在肺部疾病的作用机制尚不清楚，有研究[25]表明MSC是通过内皮素（endothelin-1, ET-1）发挥其促BOS的作用。目前，对于MSC达到多少数量才可以早期预测BOS的发生，以及MSC数量是否与BOS的程度相关尚未定论。

5 CC趋化因子

CC趋化因子具有募集淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的作用，目前CC趋化因子在BOS病理过程中的重要作用已被重视[26]。研究[27]提示肺移植术后血清中胸腺和活化调节趋化因子（CCL17/TARC）水平可以作为BOS的预测指标。Paantjens等[24]测定了54例肺移植患者术前、术后血清中TARC水平，发现测定术后第1年内血清TARC水平有助于预测BOS，TARC≤325 pg/mL的患者发展成为BOS的特异性和灵敏性分别为71%和80%。Reynaud等[28]建议将其连同另一个CC趋化因子MCP-1作为预测BOS早期敏感诊断的指标。Verleden等[29]通过检测77例肺移植患者BALF中34种不同细胞因子的表达情况，发现正常肺移植患者与发展成BOS的患者BALF中MCP-1、CCL3、CCL4、CCL17、CCL18的表达有显著差异。上述研究提示检测CC趋化因子对预测BOS有一定的价值。

6 可溶性蛋白

T细胞介导的自身免疫反应在BOS的发生中具有重要的作用[30]。当CD30+的T细胞活化后，释放可溶性CD30（solubleCD30、sCD30）入血。Bauwens等[31]在术前检测38例肺移植患者血清中sCD30的水平，发现术前高水平sCD30（＞20 U/mL）的患者与低水平sCD30（≤20 U/mL）患者相比有显著的无BOS生存期优势。Golocheikine等[32]通过连续测定肺移植患者血清sCD30水平，发现发展成为BOS的患者较未发展成为BOS的患者血清sCD30升高（P＜0.05），在临床诊断BOS的（7.57±2.63）个月前就发现了此差异，因此其建议将血清sCD30升高作为BOS的早期预测指标。Fields等[33]持续跟踪40例肺移植患者血清sCD30水平得到与Golocheikine相同的结论。

Kwakkel等[34]认为不能将sCD30作为BOS的预测指标，他们测定了14例接受他克莫司/霉酚酸酯治疗方案的肺移植患者血清样本中的sCD30水平，其中7例患者发展成为BOS，但在移植术前和术后均未发现与正常患者相比sCD30有统计学差异。Kwakkel的研究证明了他克莫司/霉酚酸酯不能通过抑制sCD30阻止BOS的发生，但未对sCD30在BOS预测中的价值进行直接反驳。sCD30作为CD30活化释放入血的活性成分，与CD30具有很好的相关性。血清中sCD30水平能够反映活化的CD30+细胞数量。因此，测定血清sCD30水平在BOS预测中有一定的价值。

除可溶性CD30外，可溶性补体蛋白CD59（sCD59）也可作为BOS的预测指标。Budding等[35]检测了肺移植后BOS患者和非BOS患者的血清sCD59含量，发现sCD59量与BOS显著相关。sCD59滴定＞400 pg/mL时，术后6个月患者生存率显著低于sCD59滴定低组。

7 KL-6

KL-6表达于II型肺泡上皮细胞及呼吸性细支气管上皮细胞，具有募集纤维母细胞促进肺间质纤维化的作用，血清KL-6水平与肺泡损伤、II型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的严重程度有关[36]。受损伤的肺泡上皮细胞释放KL-6促进成纤维细胞分化成肌成纤维细胞[37]。Walter等[38]检测了26例肺移植患者血清KL-6水平，其中8例为BOS患者，发现血清KL-6水平同FEV1下降相关（r=0.44,P＜0.05），BOS患者与正常肺移植患者血清KL-6浓度的平均数±标准偏差分别为（688.7±225.8）U/mL、（321.3±163.9）U/mL，该结果说明血清KL-6检测有作为BOS早期诊断指标的潜力。最近Haberman等[39]的研究也证明了血清KL-6在诊断BOS中的价值，KL-6≥200 U/mL早期预测BOS的敏感性为67%，特异性为95%；因此认为血清KL-6可以作为移植术后早期诊断BOS的特异性指标。Ohshimo等[40]比较了BALF中NE和血清KL-6对BOS的预测价值，认为检测血清KL-6较BALF中NE更有助于早期诊断BOS。

8 Clara细胞分泌蛋白

Clara细胞分泌蛋白（Clara cell secretory protein, CCSP）由分布于终末细支气管和呼吸性细支气管的无纤毛上皮细胞（Clara细胞）分泌，具有抗炎、抗纤维化的生物学活性。上皮损伤或非正常修复后，再生的上皮细胞失去分泌CCSP的能力。Nord等[41]进行了一项包含22例肺移植患者的队列研究，发展成为BOS的患者与急性排斥反应或者无排斥反应的患者相比，其血清和BALF中CCSP显著下降，表明检测血清和BALF中CCSP水平可以预测BOS的发生。Bourdin等[42]随访63例肺移植患者，发展成为BOS的患者在移植术后3个月内BALF中CCSP水平和CCSP/IL-8比率已低于正常患者，并持续性下降，验证了BALF中CCSP下降对于BOS的预测作用，同时提出供体CCSPA38G基因多态性与患者术后并发BOS相关。上述研究均表明术后CCSP下降，尤其是BALF中CCSP下降对BOS的预测作用。因此，CCSP的表达可能对BOS的发生有一定的预测作用。

9 内皮素1

内皮素1（endothelin-1, ET-1）是由21个氨基酸组成的多肽，具有调节血管舒缩张力、激素分泌等功能[43]。研究[43,44]表明ET-1对肿瘤，自身免疫疾病等的发生发展有影响。ET-1在肺移植物失功中的病理生理过程中发挥着重要作用，对预测移植物失功也有一定作用[25]。Salama等[45,46]证实了ET-1浓度升高在BOS预测中的价值，ET-1主要通过控制间充质细胞来促进BOS的发生；Logistic回归分析发现，术前ET-1浓度和术后3个月、12个月的血清ET-1浓度升高可以预测BOS，单因素比值比（univariate OR）和95%置信区间（con fidence interval, CI）分别为1.01（1.004-1.025）、3.1（1.21-9.92）、3.9（1.42-10.80）。上述研究说明ET-1在BOS的发生发展中起着重要作用，有可能通过控制其他细胞促纤维增生而使终末呼吸道纤维化，同时检测血清和BALF中ET-1浓度在一定程度上可以预测或早期诊断BOS的发生。

10 金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）和金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs）

上皮细胞损伤、炎症、纤维化及气道闭塞与术后闭塞性细支气管炎相关[47]，纤维化是纤维增生（即细胞外基质合成增加）和纤维分解（即细胞外基质降解）不平衡的结果，包括MMPs和TIMPs在内的蛋白质参与胞外基质成分平衡的维持[48]。研究[49]证实，MMPs和TIMPs在BOS患者肺组织中有表达改变。Hubner等[50]对出现肺纤维增生影像学表现的肺移植患者跟踪测定MMP-9和TIMP-1的表达，结果显示，BOS患者的移植肺表达MMP-9和MMP-9/TIMP-1比值均显著升高。Smith等[51]研究证实BALF中MMP-8、MMP-9和TIMP-1在术后2年内升高与之后发生BOS相关。亦有报道[12,51-58]表明MMPs家族的其他成员如MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-12等表达的改变与BOS发生相关，但这些MMPs在预测BOS中的价值现证据不够充分。

11 MiRNAs和基因表达

Xu等[58]检测了肺移植后儿童体内循环miRNA的水平，发现BOS患者的miR-134、miR-10a、miR-195和miR-133b显著低于非患病组，而miR-144、miR-142-5p和miR-155显著低于非患病组。Budding等[59]认为BOS患者血清中miR-21、miR-29a、miR-103和miR-191的水平显著高于非BOS组。提示特定的miRNAs可作为预测BOS的指标。

此外，Danger等[60]利用qPCR检测外周血中的基因表达，对比BOS组和非BOS组，提出CD19、BLK、POU2AF1、TCL1A和IGLL5五种可作为预测标记的高表达基因，以及IGLL5和TCL1A两种可作为诊断标记的基因。

12 结语

肺移植是治疗终末期肺病的有效方法。受制于移植术后BOS的发生，肺移植长期生存率较低[1]，BOS的中位生存时间仅为3年-4年。寻找BOS的预测指标，提高BOS的早期发现率并提前干预，有助于延长肺移植患者的生存[6]。经过多年研究，已经证实免疫调节细胞、分泌性蛋白质等指标在预测肺移植术后BOS的发生中具有一定的价值，如NE、Treg、CD4+CD28+T细胞、白介素、C反应蛋白、ET-1、KL-6等；其中NE、sCD30对预测BOS的研究较多，临床应用的价值较为认可。同时，也有学者在探索其他类型的标记物，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）[62]、微生物[63]、呼气一氧化碳[64]、YKL-40[65]、1H NMR[66]、HLA-G[67]等。随着BOS发生机制研究的深入，大样本临床试验的开展，更多高灵敏度、特异性的BOS预测指标将为肺移植术后BOS患者带来长期生存的希望。