长链非编码RNA调控白血病多药耐药机制的研究进展

李美玲(综述), 鹿全意(审校)

白血病是造血系统的一种恶性克隆性疾病，以异质性高、预后差为主要特征，目前化疗仍是治疗白血病的主要手段之一。然而，多药耐药及治疗后复发是白血病治疗失败的关键环节，多个因素参与白血病的耐药机制，包括ABC转运蛋白介导的多药耐药、DNA修复异常、骨髓微环境的变异、非编码RNA[包括环状RNA(circular RNA，circRNA)、微小RNA(micro RNA，miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)]的表达异常等[1-4]。

LncRNA是一类长度>200 nt的异质性转录产物，于2002年被首次发现[5-6]。直至2007年，随着第一个LncRNA Hotair(homeobox transcript antisense RNA，Hotair)作为染色体调控基因被发现，LncRNA生物学功能才得以被高度关注。LncRNA可在表观遗传、转录及转录后翻译等水平上调控基因表达，其本身的异常表达除了在实体瘤对蛋白编码基因表达的特殊调控外，还参与血液肿瘤的发生和发展，包括细胞的增殖、凋亡和迁移，而且是白血病化疗耐药和治疗预后差的主要原因之一[7-9]。然而，与其他类型的癌症相比，LncRNA在正常和恶性造血中的作用至今尚未得到广泛评价。笔者就LncRNA通过ABC转运蛋白、作为miRNA海绵体、调控糖基化、细胞周期及通过PI3K/AKT途径等介导白血病多药耐药机制进行综述。

1 LncRNA通过ABC转运蛋白调控白血病多药耐药

化疗药物需通过细胞膜或核膜进入胞质或核内才能发挥细胞毒作用，而耐药细胞可通过异常表达膜转运蛋白将化疗药物泵出细胞或改变其在细胞内的分布从而导致耐药的产生[10]。ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族拥有49种转运蛋白，可将化疗药物转运出细胞以降低细胞内浓度，从而使药物对细胞丧失毒性作用而产生耐药[11]。P-糖蛋白(P-gp)是由ABCB1即MDR1基因编码的ATP依赖的有机泵，具有与胞内核苷酸结合的结构域，底物与该有机泵结合致使P-gp的构象发生改变，将底物转运到细胞外，随后P-gp结合ATP恢复其构象，从而循环泵出药物[12]。有研究表明，在K562和THP-1细胞系中过表达NEAT1(核旁核聚集转录因子，一种核限制性LncRNA)可抑制白血病细胞中ABCG2的表达，从而减轻Alisertib、硼替佐米等细胞毒性[13]。Pouyanrad等也报道相似结果，显示NEAT1和LncRNA转移相关肺腺癌转录物1(MALAT1)通过结合miR-335-3p靶向调控ABCA3的表达，介导白血病的多药耐药[14]。可见，LncRNA可通过影响ABC转运蛋白表达引发药物外排机制介导白血病多药耐药。这是耐药发生的基本机制之一(图1)。

2 LncRNA作为竞争性内源RNA调控白血病多药耐药

LncRNA可以诱饵方式吸附一些特定的miRNA，从而调控这些miRNA靶基因的表达，这种作用方式被称为“海绵效应”(miRNA sponge)，具有该作用的LncRNA 被称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)[15]。随着二代测序技术的发展和肿瘤转录组学数据的分析，目前已发现超过10 000种LncRNA 可能具有潜在的ceRNA特性[16]。LncRNA作为miRNA和mRNA的竞争平台，在乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌和肾癌等多种恶性肿瘤中参与细胞周期和细胞凋亡调控，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用[17-21]。在白血病的耐药机制研究中，Zhou等在耐伊马替尼的人K562细胞和慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)患者中发现，LncRNA MEG3显著下调，过表达MEG3则细胞增殖降低，凋亡增加[22]。更有趣的是，在该类患者中MEG3与miR-21结合，且表达量呈负相关，表明在白血病中，MEG3通过结合miR-21以海绵效应方式调控细胞增殖、凋亡和多药耐药转运体的表达，从而促进伊马替尼耐药。Xiao等报道，LncRNA UCA1作为MDR1的重要调控因子，通过与MDR1竞争性结合miR-16，调控白血病细胞对伊马替尼耐药[13]。此类耐药机制是耐药的主要原因之一(图2)。

3 LncRNA通过N-链蛋白糖基化调控白血病多药耐药

蛋白糖基化是翻译后最常见的修饰之一，糖基化改变是肿瘤细胞的共同特征，在多种生理病理过程中起着重要作用，其中N-链糖基化参与多种生化和细胞过程[23-24]。肿瘤相关聚糖、糖基转移酶及其靶蛋白在肿瘤细胞内的差异表达，作为特异性肿瘤标志物和潜在治疗靶点已被研究。N-链糖基被证明可改变癌细胞的恶性表型，其在耐药产生过程具有调控作用[25-26]。糖基转移酶在肿瘤细胞内的差异表达是导致肿瘤糖基化异常的主要原因之一，天氡酰胺糖基化(asparagine-linked glycosylation，ALG)家族是糖基转移酶的重要组成部分[27]。ALG3编码α-1,3 -甘露糖基转移酶，参与内质网中多帖醇链高甘露糖型糖基的形成[28]。Liu等对急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia, AML)细胞耐药过程中的N-链聚糖检测发现，ALG3在AML细胞系中的表达与MDR呈正相关[28]。LncRNA FTX作为一种竞争性的内源性RNA，通过海绵miR-342调控AML中ALG3的表达，一方面FTX以序列特异性的方式与miR-342结合并调控miR-342表达，两者表达水平呈负相关；另一方面，使FTX和MDR通过ALG3途径的表达呈正相关。同时发现，FTX的下调抑制AML细胞株对阿霉素的耐药性，而miR-342抑制剂则恢复AML细胞对药物的敏感性，表明ALG3(负责甘露糖基化)与AML细胞的耐药性有关，证实在化疗的AML患者中LncRNA可通过调控甘露糖基化影响细胞耐药[28]。提示高甘露糖N-聚糖的改变可能是AML耐药的特异性改变之一，这种耐药特异性变化使得高甘露聚糖有望作为AML耐药早期诊断的潜在生物标志物(图3)。

4 LncRNA通过调节细胞周期调控白血病多药耐药

细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，通常分DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、细胞分裂期(M期)。化疗药物通过诱导DNA损伤，细胞分裂使细胞周期改变而导致细胞凋亡。当细胞修复损伤能力增强、缺乏识别损伤能力、失去向凋亡机制发出信号的能力、凋亡机制本身出现缺陷时，就可能导致耐药产生。MALAT1在CML细胞中表达增加，当沉默MALAT1时通过靶向miR-328抑制CML细胞增殖和细胞周期阻滞，增加伊马替尼耐药K562细胞的药物敏感性，促进细胞凋亡。MALAT1的下调增强K562细胞对伊马替尼的敏感性，而miR-328的沉默则抵消这种效应，证实通过海绵miR-328沉默MALAT1阻滞细胞周期，增加K562细胞对伊马替尼的敏感性[29]。Zhang等研究认为，急性早幼粒细胞白血病NB4细胞中HOTAIRM1的下调延缓全反式维甲酸(ATRA)诱导的粒细胞分化，导致未成熟和增殖细胞明显增多，维持细胞周期从G1期进展到S期；相应地，HOTAIRM1基因的下调导致了许多ATRA抑制的细胞周期和DNA复制基因的保留表达，并减弱了ATRA对细胞表面白细胞活化、防御反应和其他成熟相关基因的诱导[30]。ATRA诱导的细胞周期阻滞发生在敲除细胞的G1/S期，其抵抗作用伴随着ITGA4 (CD49d)的保留表达和ITGAX (CD11c)诱导的降低。研究还证实,没有经过ATRA处理的ITGAX也会干扰HOTAIRM1基因的转录水平，提示整合素基因作为细胞周期进展与时间的耦合调节开关，控制从增殖阶段到粒细胞成熟的转变[30]。结果表明，HOTAIRM1通过在基因表达水平上调节整合素控制的细胞周期进程。Bester等通过双蛋白编码和非编码的整合CRISPRa筛选全基因组平台，对LncRNA功能表征，计算和功能分析确定细胞周期、存活/凋亡和癌症信号基因，分析发现LncRNA GAS6-as2的转录激活导致GAS6/TAM通路过度激活，这是包括AML在内的多种癌症的耐药机制，进一步证实了LncRNA GAS6-as2通过GAS6/TAM通路诱导凋亡和细胞周期阻滞[31]。这是AML常见耐药机制之一。

5 LncRNA通过PI3K/Akt/mTOR途径调控白血病多药耐药

磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶点(phosphoinositide 3-kinase /protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信号传导途径不仅在实体瘤有着重要的调节作用，在血液系统肿瘤中可激活下游基因或蛋白表达调控造血细胞的增殖、分化及凋亡[32-33]。PI3K是一种脂质激酶，可在质膜和胞内磷酸化磷脂酰肌醇3位羟基位点。Akt作为PI3K的重要下游靶蛋白，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，又称为蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)。LncRNA在多种癌细胞中调节PI3K/Akt/mTOR途径，如在肝癌中显著上调的LncRNA HULC通过激活胶质肿瘤细胞中的PI3K/Akt/mTOR途径促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[10]。研究发现，50%～80%的AML患者PI3K/Akt/mTOR途径异常激活，提示PI3K/Akt/mTOR途径有望成为新的治疗靶点，并已有相关药物开发[34-35]。在AML中，LncRNA通过激活AML细胞中的PI3K/Akt/mTOR途径，在白血病的发生发展及预后起着重要作用。Yang等报道，在阿霉素耐药的KG-1和HL-60细胞中，Linc00239高度调节PI3K/Akt/mTOR途径活化，积极调控细胞的恶性行为包括耐药作用、细胞的增殖、集落形成和迁移，提示Linc00239扮演PI3K/Akt/mTOR途径激活剂作用，可被视为AML治疗靶标[36]。这些数据表明，LncRNA与PI3K/Akt/mTOR途径的激活或失活紧密相关，尤其在白血病耐药机制中可作为逆转耐药的治疗靶点。

现将与白血病化疗耐药相关的LncRNA部分研究进行统计，其中涉及的耐药机制所属如下(表1)：(1)LncRNA通过ABC转运蛋白调控白血病耐药：序号为1，6，10；(2)LncRNA通过海绵机制调控白血病耐药：序号为1，2，3，5，6，8；(3)LncRNA通过N-链蛋白糖基化调控白血病耐药：序号为3；(4)LncRNA通过PI3K/Akt/mTOR途径调控白血病耐药：序号为7，11；(5)LncRNA通过调节细胞周期调控白血病耐药：序号为9，12，13。

表1 与白血病化疗耐药相关的部分LncRNA研究

化疗是白血病的主要治疗方法，但维持长期完全缓解的病例并不多见。化疗多药耐药的产生及其机制研究仍是血液肿瘤医生不断探索的方向。越来越多的实验研究证实，LncRNA可以通过多种途径调控白血病的多药耐药，但白血病耐药是一个复杂的过程，可能是一种机制独立起作用，也可能是多种机制联合诱导耐药，更可能是耐药机制交叉调控的结果。白血病关于LncRNA在耐药的认识仍是冰山一角，且多数停留在体外和细胞水平，离广泛应用于临床还差之甚远，亟需更深入的多靶点、多层面、多途径丰富的功能及机制研究。目前开展的基因转录组学和首次发现的白血病耐药的糖生物学方面都需要更多的拓展深入和验证。尽管LncRNA在白血病多药耐药中的研究仍在早期阶段，但不能否认和忽视的是LncRNA作为分子靶标治疗白血病及逆转白血病耐药的潜力。因此，阐明与白血病耐药相关的LncRNA的功能和作用机制，更多样更深入的研究仍是任重道远。