青枣果酒酿造工艺优化及其香气成分分析

原潞，李桂峰，燕妮，吴建虎，杜俊杰

（山西师范大学食品科学学院，山西临汾041004）

枣（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科植物枣树的果实，在我国已有四千年的历史，其种植面积广泛，具有药食同源的功效[1]。枣果富含碳水化合物、酚类化合物、皂苷类、生物碱类、三萜酸[2-5]等，具有增加免疫力，防治心血管疾病，预防癌症，抗氧化[6-8]等功效。山西是中国枣果重点产区之一，枣的种植面积逐年增加，年产量逐年提高，但由于其产业化程度低，缺乏市场竞争力，已经不能满足市场的需要，造成大量枣滞销，枣业面临严峻困局[9]。因此，采用新思路和开发新产品改变枣业低迷不振的现状迫在眉睫。

目前，有关枣产品的研究主要集中在红枣酒发酵工艺优化及红枣汁与饮料加工工艺等方面，如彭方杰等采用Box-Behnken试验设计大枣果酒发酵条件进行了优化[10]。Jingjing Guo等对经酶解和未经酶解处理的红枣酒精饮料的化学成分和挥发性成分进行了研究[8]。研究发现，青绿色枣果总酚、总黄酮、维生素含量以及抗氧化能力均明显高于成熟的红枣，因此开发青枣产品更加符合人们对高营养的产品的消费需求。果酒是以水果为原料经发酵酿造而成的低度饮料酒，其营养丰富，风味独特[11]。但以青枣为原料酿造果酒的相关研究未见报道。

本研究以青枣作为原料酿造果酒，酒精度和感官评分为综合评价指标，采用单因素试验结合响应面优化试验，对青枣果酒的酿造工艺进行优化，得到最优发酵参数并用气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对青枣果酒的香气成分进行测定和分析，酿造的果酒，不仅其营养成分含量高、抗氧化能力强和香气饱满，还解决了传统红枣酒易浑浊、略带苦味等的问题，为开发枣产品提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青枣：山西木枣，采于山西省吕梁市临县三交镇；酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（食品级，酶活力30 000 U/g）：河北格贝达生物科技有限公司；焦亚硫酸钾（食品级）：烟台帝伯仕有限公司。

1.2 主要仪器与设备

DZKW-D-4型电热恒温水浴锅：上海科恒实业发展有限公司；DPX-90520B-2型恒温培养箱：上海华光仪器仪表厂；75 μm CAR/PDMS型SPME萃取头：美国Supelco公司；6890N-5973气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 青枣果酒酿造工艺流程及操作要点

青枣→挑选、清洗→软化→果胶酶处理→调糖→SO2护色→酵母活化→接种发酵→后发酵→澄清过滤→灌装→检验→成品

挑选无腐烂、无霉变的青枣，清洗，去核；青枣和水比例为 1 ∶2（g/mL），90 ℃ 的水浴软化 8 min ～10 min；进行酶解，果胶酶用量0.3%，在40℃酶解3 h；榨汁，滤去枣皮等物质，得到青枣汁；添加白砂糖调整果汁的初始糖度，接种一定量酵母，于23℃～25℃恒温箱发酵，一定时间内完成主发酵。滤去酵母发酵代谢产生的代谢物残渣，进行后发酵，时间为1个月。采用巴氏灭菌的方法，对青枣果酒进行灭菌处理，即得成品。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 初始糖度对青枣果酒的影响

固定酵母添加量0.3%，发酵时间7 d，SO2添加量80mg/L，初始糖度分别为18%、20%、22%、24%、26%，以酒精度和感官评分为评价指标，对青枣果酒进行品质评价。

1.3.2.2 酵母添加量对青枣果酒的影响

固定初始糖度22%，发酵时间7 d，SO2添加量80 mg/L，酵母添加量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，以酒精度和感官评分为评价指标，对青枣果酒进行品质评价。

1.3.2.3 发酵时间对青枣果酒的影响

固定初始糖度22%，酵母添加量0.3%，SO2添加量 80 mg/L，发酵时间分别为 3、5、7、9、11 d，以酒精度和感官评分为评价指标，对青枣果酒进行品质评价。

1.3.2.4 SO2添加量对青枣果酒的影响

固定初始糖度22%，酵母添加量0.3%，发酵时间7 d，SO2添加量分别为 0、40、80、120、160 mg/L，以酒精度和感官评分为评价指标，对青枣果酒进行品质评价。

1.3.3 青枣果酒发酵工艺响应面优化

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken的中心组合设计原理，作四因素三水平响应面优化试验，以酒精体积分数（Y1）和感官评分（Y2）为双响应值，对青枣果酒主发酵工艺条件参数进行优化。响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平编码表Table 1 Coding of factors and levels of response surfaces

1.3.4 指标测定

酒精度的测定：参照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中酒精计法[12]。

感官评分：参照文献[12-13]方法。选7名食品专业人员分别从产品的外观、香气、滋味、典型性4个方面进行感官评分，采用百分制。具体感官评分标准见表2。

表2 感官试验评定标准Table 2 Grade standard of sensory experiment

1.3.5 青枣果酒香气成分分析

样品处理：取10 mL装入顶空瓶，密封，以顶空方式萃取青枣果酒中的挥发性成分。条件为：恒温水浴锅60℃，萃取30 min。色谱条件分析：HP-5MS（30 m×0.25μm×0.25mm）色谱柱；载气为氦气，流速为1mL/min；进样口温度为250℃，不分流进样。程序升温条件：初始柱温40℃保持2 min，再以6℃/min升温至300℃，保持5 min，溶剂延迟：3.5 min。质谱条件分析：电离子源（electron ionization，EI），离子源温度230℃；电子能量70eV；四级杆温度为150℃，倍增管电压1.2kV，扫描质量范围m/z35～550。定性和定量分析：使用NIST Library数据库进行谱图分析，对检测出的香气物质进行物质定性分析，通过峰面积归一化法计算各物质的相对含量[14]。

2 结果与分析

2.1 青枣果酒单因素试验结果分析

2.1.1 初始糖度对青枣果酒发酵的影响

初始糖度对青枣果酒发酵的影响如图1所示。果酒酵母菌通过发酵葡萄糖等有机物进行酒精发酵，因此，需要添加一定量的糖。

图1 初始糖度对果酒发酵的影响Fig.1 Effect of the initial sugar on fermentation of fruit wine

由图1可知，随着发酵液初始糖浓度的增加，酒精度逐渐增高，感官评分先上升后下降。在初始糖浓度过低时，酒度和感官评分值均较低，说明明显影响了酵母的发酵过程[15]，酒精度含量低，风味不足。而糖度过高时，酵母自身繁殖利用增多，导致酒度低且成本投入大。综合考虑，选取20%、22%、24%作为青枣果酒发酵响应面对应因素水平，以确定最佳发酵条件。

2.1.2 酵母添加量对青枣果酒发酵的影响

酵母添加量对青枣果酒发酵的影响如图2所示。

图2 酵母添加量对果酒发酵的影响Fig.2 Effect of yeast addition on fermentation of fruit wine

由图2可知，随着酵母添加量的增多，发酵液的酒精度呈快速增长的趋势，当酵母添加量为0.3%时，酒精度达到最大值为13.23%vol；感官评分也达到最高值85.43分。酵母添加量大于0.3%时，酒精度和感官评分开始下降，这可能是因为随着酵母接种量的增大，发酵太快，导致发酵液中的糖更多的消耗于酵母本身生长，酒度不高，酒体寡淡[16-17]。综合考虑，选取0.2%、0.3%、0.4%作为青枣果酒发酵响应面对应因素水平，以确定最佳发酵条件。

2.1.3 发酵时间对青枣果酒发酵的影响

发酵时间对果酒的酒精含量和风味品质影响较大。发酵时间对青枣果酒发酵的影响如图3所示。

图3 发酵时间对果酒发酵的影响Fig.3 Effects of fermentation time on fermentation of fruit wine

由图3可知，青枣果酒在发酵前7 d时，酒精度增长较快，之后增长速度趋于缓慢，可能是由于发酵液中的糖转化较完全，发酵基本接近终点；此时酒体浓郁，口感适宜，果酒品质优良。为了保持果酒口感，选择发酵时间为7、9、11 d作为响应面对应因素水平，以确定最佳条件。

2.1.4 SO2添加量对青枣果酒发酵的影响

SO2添加量对青枣果酒发酵的影响如图4所示。

图4 SO2添加量对果酒发酵的影响Fig.4 Effect of SO2on fermentation of fruit wine

由图4可知，随着SO2添加量的增多，酒精度逐渐降低，可能是因为刚加入的SO2会抑制酵母菌的活性，影响发酵的结果。感官评分呈现先下降后上升再缓慢下降；当SO2添加量为80 mg/L时，达到最大值79.57分。综合上述各因素考虑，选取40、80、120mg/L作为青枣果酒发酵响应面对应因素水平，以确定最佳发酵条件。

2.2 响应面试验优化青枣果酒酿造工艺

2.2.1 回归方程的建立与方差分析

以果酒酒精度（Y1）和感官评分（Y2）作为双响应值，响应面试验设计方案与结果见表3，方差分析见表4。

表3 响应面试验设计方案与结果Table 3 Design program and results of response surfaces

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

续表4 回归模型方差分析Continue table 4 Variance analysis of the regression model

应用对表3的数据进行多元回归方程拟合，分别得到酒精度（Y1）和感官评分（Y2）的二次回归模型分别为：

由表 4 可知，酒精度（Y1）和感官评分（Y2）模型的P值均＜0.000 1，可知回归模型方差极显著，拟合度较好；失拟项P值分别为0.050 2和0.575 5，均大于0.05，不显著，表明通过试验得到的二次回归方程能较好地预测结果[18-19]。以酒精度为响应值时，一次项A、B、C交互项 AC、AD、BC、BD 以及二次项 B2、C2、D2均表现为显著；在模型交互项中，AB、CD交互项的显著性较差，说明发酵是多因素相互作用的结果。通过主因子效应分析可以得出[20-21]，试验因素对酒精度影响的强弱顺序为：初始糖度＞发酵时间＞酵母添加量＞SO2添加量。以感官评分为响应值时，一次项A、C、D和交互项AB、AD、BC、CD ，二次项 B2、C2、D2均为显著，同样，试验因素对感官评分影响的强弱顺序为：初始糖度＞发酵时间＞SO2添加量＞酵母添加量。

二次多项式模型酒精度（Y1）和感官评分（Y2）的决定系数分别为0.972 9和0.979 5，这表明所建立的模型能够较好地拟合因子与响应值之间的关系。

2.2.2 响应值相互结合的响应面和等高线分析

图5 各因素交互作用对果酒酒精度和感官评分影响的响应面Fig.5 Response surface of the effects of the interaction of various factors on wine alcohol and sensory score

各因素交互作用对果酒酒精度和感官评分影响的响应面见图5。由图5可知，在所选范围内是存在极点的，两者相互之间影响的三维响应面和等高线均呈现椭圆形，存在极值，且坡度较陡，表明三者之间的交互作用显著；随着初始糖度和酵母添加量、发酵时间、SO2添加量之间变化时，酒精度和感官评分均呈现出先升高后缓慢下降趋势，因为前者坡度较陡交互作用显著，而后者之间交互作用的坡度较平缓交互作用不显著[21-22]。

2.2.3 发酵工艺参数的优化和验证

通过Design expert软件分析得到青枣果酒酿造的最优工艺条件为：初始糖度24%，酵母添加量0.32%，发酵时间8.92 d，SO2添加量 92.08 mg/L，此时，所酿得的青枣果酒酒精度和感官评分的预测值分别为：15.2%vol、88.96分。考虑到实际操作的可行性，修正工艺条件为：初始糖度24%，酵母添加量0.3%，发酵时间8 d，SO2添加量80 mg/L。在此优化条件下进行3次平行性试验，所酿得的果酒色泽透亮，酒体饱满，枣香浓郁，口感纯正，酒精度15.0%vol，感官评分87分，结果与预测值相差较小，研究结果具有一定的理论和实践意义。

2.3 青枣果酒香气成分的GC-MS分析

青枣果酒中的挥发性香气物质成分鉴定结果如图6和表5，根据GC-MS结果分析可知，青枣果酒中分离出的色谱峰中共鉴定出其中21种化合物，占可检出挥发性成分总量的99.58%。

表5 青枣果酒香气成分GC-MS鉴定结果Table 5 Volatile aroma components of green jujube wine

续表5 青枣果酒香气成分GC-MS鉴定结果Continue table 5 Volatile aroma components of green jujube wine

青枣果酒中的香气物质主要以醇酯类物质为主，是酵母等多种微生物共同作用的结果。醇类化合物是果酒香气一类重要的化合物，主要是由氨基酸和糖的降解产生[22]。从表5可知，苯乙醇含量最高，通过艾氏途径，果酒中的L-苯丙氨酸在酶的作用下转化生成苯乙醇[23]。其中相对含量较高的物质有苯甲酸苄酯12.91%、邻苯二甲酸二丙酯8.85%、邻苯二甲酸二异丁酯6.63%、对羟基苯乙醇3.27%、十六酸2.80%、琥珀酸单乙酯2.40%、油酸1.73%。

3 结论

采用响应面法优化青枣果酒发酵工艺条件，通过建立模型验证，表明该模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定的实际价值。优化后最佳发酵工艺条件为：初始糖度24%，酵母添加量0.3%，在23℃发酵8 d，SO2的添加量为80 mg/L；在此工艺条件下，得到的青枣果酒酒精度达15.0%vol，感官评分87分；产品酒体色泽透亮，呈金黄色，酸甜适度，具有令人愉悦的果香和酒香。果酒香气成分主要包含醇类、酯类、酸类、醛类等，可作为青枣果酒的重要品质指标，同时为青枣果酒酿造提供理论依据和技术参考。青枣果酒中共鉴定出21种香气成分，其中相对含量较高的物质有：苯乙醇47.84%，对羟基苯乙醇3.27%，苯甲酸苄酯12.91%，邻苯二甲酸二丙酯8.85%，邻苯二甲酸二异丁酯6.63%。