铁线莲Inspiration组培继代培养基的筛选与优化

杨利平 陈乃明 王鹏良 陈丽文 杨琼 李芳菲 何贵整

摘要：以三年生铁线莲Inspiration当年萌发的新芽为外植体获得无菌芽，从MS营养元素成分及植物生长调节剂2个方面探究最适宜铁线莲Inspiration继代增殖的培养基组成。结果表明，大量元素对继代培养的影响最大，铁盐次之，微量元素影响最小，铁元素浓度低于MS全量时，铁线莲Inspiration继代苗叶片发黄，继代培养基营养成分最优组合为1/2大量元素+1/4微量元素+1/3有机物+3/2铁盐;6-BA与NAA间存在互作关系，浓度比值在3～6之间时，丛生芽的增殖效果最好，增殖系数在2.5以上，经筛选优化，最优激素配比组合为6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L。最优营养元素和最优激素的组合可使得铁线莲Inspiration继代增殖系数达到2.76。

关键词：铁线莲Inspiration;继代培养;筛选;优化

中图分类号：S687.304+.3   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）14-0083-04

铁线莲为毛茛科（Ranunculaceae）铁线莲属（Clematis L.）植物，是一种观赏价值高、抗逆性强的藤本花卉，该物种共有300余种原生种，广泛分布于各大洲，其中以北半球的亚热带和温带地区为多[1-3];我国有近50%原生种，分布范围北至吉林省，南至云南省[4]。该物种花大叶美，主要用于庭院绿化和园林造景，被誉为“攀缘植物皇后”，另外根和全草可供药用，根具有通经络、解毒、祛瘀之效，可治疗痛风和虫蛇咬伤，具有重要的药用价值。

铁线莲品种Inspiration的花瓣呈深粉红色，轮转形排列，雄蕊呈黄色，花色美丽，花期较长，非常适合依托针叶和落叶灌木生长，是一个理想的盆栽品种。铁线莲属植物存在结实少，种子发芽率低，栽培品种大多为杂交种，种子繁殖无法保证其品种的特性[5]，分株繁殖速度较慢等特点;通常铁线莲繁殖方式以扦插繁殖为主，但扦插繁殖系数较低，且不易生根，品种易退化[6-7]。这就导致了种苗不够充足，无法满足市场需求。

目前，花卉企业的铁线莲属植物多以进口为主，且苗木价格普遍偏高[8-9]。因此建立铁线莲的组培快繁技术体系可有效解决以上种苗繁育过程中存在的问题。目前相关文献对铁线莲组培体系的建立主要通过愈伤组织实现，容易造成突变[4，8]，但极少采用以芽繁芽方式，采用以芽繁芽方式获得的苗木能较好地保持品种的稳定性。本研究首先采用腋芽为外植体获得无菌芽，进而进行继代培养基营养成分和激素配比的筛选及优化，旨在提高铁线莲Inspiration的繁殖效率，为该品种产业化提供技術参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以三年生的铁线莲Inspiration植株为材料，以其当年生带芽茎段为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌芽的获得

春季晴天从三年生铁线莲品种Inspiration健壮无病虫害的当年新生枝条上剪取带芽茎段，去除叶片，并将茎段剪成8～10 cm长度，放入容器内用洗洁精水溶液浸泡5 min，用软毛牙刷刷洗后，用清水清洗5～6次，沥干后，置超净台上备用。将表面清洗过的外植体用0.1% HgCl2溶液消毒7～12 min后，用灭菌水清洗5～6次，在超净台上切成2 cm左右的茎段，每个茎段保留1～2个腋芽，将处理后的茎段接种到继代培养基上，为防止交叉污染，每瓶培养基接种1条茎段，培养基选用未添加任何激素的MS培养基，待萌出新芽后，转至MS+0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.05 mg/L 萘乙酸（NAA）的培养基上进行增殖培养。

1.2.2 增殖培养基营养成分的筛选

试验选用MS培养基为基本培养基，大量元素（D）、微量元素（W）、有机成分（Y）、铁盐（F）为试验因子，进行四因素三水平的正交试验，忽略因子间交互作用，按照L9（34）正交试验表设计，各因子水平及浓度配比见表1、表2，培养基附加：蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.05 mg/L，培养基pH值为5.8～6.0。每个处理5瓶，每瓶接种5株外植体，3个重复。

1.2.3 组培继代苗激素组合的优化

本试验采用二因素完全随机设计，选用“1.2.2”节中获得的最优营养元素组合培养基，将长势基本一致的不定芽从基部切下，接种于添加不同浓度6-BA（0.20、040、0.60 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.20 mg/L）的培养基中，每个处理接种5瓶，每瓶接种5个芽，4个重复。

1.2.4 培养条件

培养条件：温度（25±2） ℃，相对湿度60%～70%，光照度 1 500～2 000 lx，光照时间12 h/d[10]。

1.2.5 数据统计与分析

试验过程中每1周观察1次芽诱导情况，继代苗接种4周后观察并记录数据。增殖系数=增殖后不定芽总数/接种的不定芽总数。采用高级版DPSv17.10对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 无菌芽的获得

将铁线莲Inspiration外植体消毒后接种至培养基上，7 d后腋芽开始萌动（图1），培养至14 d时大部分茎段的腋芽已萌动。待腋芽逐渐伸长至3～5 cm 后，去除顶端优势，转至增殖培养基上，培养 28 d 左右形成丛生芽（图2）。试验过程中发现，虽在培养室中培养，但冬季Inspiration的增殖效果较春、夏、秋季依然略低，这可能与铁线莲属多年生草本植物在自然条件下冬季落叶有关。

2.2 MS培养基营养成分的差异比较

由表3可见，在正交试验的试验组合中，MS培养基中大量元素及铁盐浓度对铁线莲Inspiration继代增殖存在影响，P值均小于0.01，达到极显著性水平，这说明MS培养基的大量元素和铁盐对铁线莲品种Inspiration的生长有极显著影响，而微量元素及有机物浓度影响则不显著。从表4可以看出，大量元素浓度为基础MS培养基的1/2时，铁线莲Inspiration继代增殖效果最佳，增殖系数达到2.33，且与1/3浓度水平差异极显著;而铁盐浓度为基础培养基浓度的3/2时对铁线莲Inspiration继代增殖的效果最好。

由表5分析可知，繁殖系数在不同组合间差异较大，繁殖系数最高为2.74，最低为1.70，二者差异极显著;由极差R值的大小顺序可知，4个因子的主次顺序为D>F>Y>W，即大量元素对铁线莲Inspiration的继代增殖影响最大，铁盐次之，微量元素影响最小。铁盐浓度低于基本MS培养基时，导致鐵线莲Inspiration继代苗叶色偏黄。综上所述，培养基营养成分最优组合为D2W1Y2F3，即1/2大量元素+1/4微量元素+1/3有机物+3/2铁盐。

从表5还可以看出，大量元素浓度降低至基础MS培养基的1/3时，铁线莲Inspiration继代增殖系数明显降低，且与1/2浓度和全量浓度水平产生较大差异，说明大量元素在铁线莲Inspiration继代增殖过程中起关键作用。微量元素及有机物浓度在1/4～1/2之间变化时，铁线莲Inspiration继代增殖系数变化未表现出明显规律性。同时，表5中反映出随着铁盐浓度的升高，增殖系数有增加的趋势。

2.3 不同激素水平对铁线莲Inspiration继代增殖影响的差异比较

双因素方差分析结果（表6）显示，6-BA浓度

（A因素）、NAA浓度（B因素）对铁线莲Inspiration继代增殖系数均产生显著影响，且6-BA和NAA之间存在显著互作关系。随着6-BA浓度增加，增殖系数有增加的趋势（表7），但当6-BA浓度达到0.6 mg/L[CM（17*2/3]时，丛生芽虽多但细弱，不利于后续生根诱导。6-BA与NAA浓度比值在3～6之间时，丛生芽的增殖效果最好，增殖系数在2.5以上。综合对比不同激素配比下丛生芽的增殖系数及生长状况发现，最优激素配比组合为6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

3 结论与讨论

目前对铁线莲组培体系的建立主要通过愈伤组织实现[4，6]，铁线莲组培苗增殖系数因品种差异在2.0～4.18间浮动[8-9，11]。本研究从MS营养元素成分及植物生长调节剂2个方面探究了最适宜铁线莲Inspiration继代增殖的培养基组成，结果表明，培养基营养成分影响继代苗增殖系数及长势，其中大量元素的影响最大，铁盐次之，微量元素影响最小;植物生长调节剂6-BA和NAA存在互作关系，随着6-BA浓度的增加，继代增殖系数有增加趋势，但当6-BA浓度浓度到达0.6 mg/L时，丛生芽细弱，不利于后续培养。本研究筛选并优化出了最适宜铁线莲Inspiration继代增殖的培养基，为1/2大量元素+1/4微量元素+1/3有机物+3/2铁盐的改良MS培养基并添加0.4 mg/L 6-BA和 0.1 mg/L NAA，该组合下增殖系数可达到2.76，且丛生芽长势健壮。

本研究发现，铁线莲Inspiration对铁元素的需求量较大，铁盐浓度低导致铁线莲Inspiration继代苗叶片发黄，当铁盐浓度达到MS全量浓度的1～3/2 时，这种情况会明显改善。这可能与铁元素参与叶绿素生物合成有关，铁元素虽然不是叶绿素的组成成分，但影响光能吸收和光合电子传递，是多种酶的组成成分，因此，叶绿素合成过程中必须有铁元素[12]。报道显示，在多种植物必需矿物元素中，铁是需求量最大的，它在多种生化反应中起重要作用[13]。

虽然在一定程度上组培育苗较传统繁殖方式更容易控制环境条件，但在研究过程中发现，铁线莲Inspiration在培养室中冬季的长势不及春、夏、秋季，冬季的增殖系数较低，且叶的长势欠佳，这可能与铁线莲属多年生草本植物在自然条件下冬季落叶有关。

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收稿日期：2019-07-29

基金项目：钦州市科学研究与技术开发计划（编号：201616802）。

作者简介：杨利平（1984—），女，河南许昌人，硕士，高级工程师，主要从事花卉的种苗繁育及栽培技术研究。E-mail：278291930@qq.com。

通信作者：何贵整，高级工程师，主要从事林木、花卉的育种、育苗及栽培产业化技术研究。E-mail：13807776795@163.com。