中国美利奴羊(新疆军垦型)同期发情处理前后外周血生殖激素的变化

王晶晶 杨华 倪建宏 卢守亮 支建忠 石国庆 刘长彬 万鹏程

摘要：研究同期发情处理中国美利奴羊（新疆军垦型）的外周血生殖激素含量变化与发情时间的关系，探讨中国美利奴羊（新疆军垦型）最佳人工输精时间。分别采集经孕酮海绵栓+PMSG肌注法处理母羊在埋栓前1 d、埋栓后 7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）和撤栓/PMSG肌注48 h的外周血，应用ELISA方法检测外周血中雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、孕酮（P）的质量浓度，分析试验母羊在同期发情处理前后外周血中生殖激素含量变化，统计分析生殖激素质量浓度的相关性和4个时间点的差异显著性。研究结果，对孕酮海绵栓+PMSG肌注法处理前后试验母羊外周血生殖激素的ELISA检测，与埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h试验羊外周血中E2、FSH、LH含量显著升高（P<0.05），P含量显著下降（P<0.05），且不同个体间不同激素含量的波动范围明显减小，达到相对一致水平，与该时间点的中国美利奴羊（新疆军垦型）集中发情现象相吻合。结果表明，孕酮阴道海绵栓+PMSG处理后的48 h是中国美利奴羊（新疆军垦型）集中发情的高峰时间，也是最佳输精时间。

关键词：中国美利奴羊（新疆军垦型）;同期发情;生殖激素;ELISA;E2;FSH;LH;P

中图分类号：S826.3   文獻标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）14-0187-05

绵羊同期发情是人为控制母羊群体同一时间发情和配种，具有便于统一饲草料配给、提高劳动生产效率和提高绵羊生殖效率的优点。生殖激素直接调控母羊发情、排卵等生殖过程，影响同期发情和人工授精的效果。绵羊属于季节性发情动物，一般是在短日照的秋季开始发情[1]，其季节性发情受到下丘脑-垂体-性腺轴的调控[2]，与绵羊的生殖激素有密切联系。目前，国内外对绵羊生殖激素季节性变化进行了相关报道。Suttie等研究发现，短日照可以促进绵羊孕酮（P）分泌，而长日照则明显地抑制P的分泌[3];Smith等发现，哺乳动物一般在发情前会出现一次雌二醇（E2）峰[4];Chemineau等研究发现，繁殖季节绵山羊血液中促黄体素（LH）和促卵泡素（FSH）浓度高于非繁殖季节，存在季节性变化[5];贺建宁等研究发现，季节性发情的滩羊的P、E2、LH、FSH浓度在春季、夏季、秋季、冬季4个季节变化明显[6]。中国美利奴羊（新疆军垦型）是我国培育的优质细毛羊品种，是典型的季节性发情哺乳动物，且每年产羔1次，每胎多为1羔。为探讨绵羊外周血生殖激素含量变化与发情时间的关系，筛选最佳人工输精时间。本研究分析繁殖季节中国美利奴羊（新疆军垦型）同期发情处理的不同阶段外周血中E2、FSH、LH和P含量的变化情况，以期为提高同期发情和人工授精成功率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018年9—11月，试验动物均采自新疆紫泥泉种羊场，中国美利奴羊（新疆军垦型）母羊共计480只，平均年龄3岁，平均体质量（38.4±1.4） kg，体格健壮，膘情较好，无生殖道疾病和乳房疾病。生殖、营养、健康等方面状况良好且个体之间无明显差异。试验处理前2周对绵羊做好防疫和驱虫工作，并加强饲养管理。从中选取20只健康的全舍饲中国美利奴羊（新疆军垦型）母羊，应用孕酮海绵 栓+330 IU PMSG（孕马血清促性腺激素）进行同期发情处理，埋栓处理 13 d 后撤栓，撤栓时肌注PMSG 330 IU。自撤栓后24～72 h，每隔12 h进行1次公羊试情，记录母羊发情时间和发情数量，计算撤栓后72 h内母羊的发情率。血样采集：在埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h，PMSG肌注前）、撤栓/PMSG肌注48 h，分别颈静脉采血 5 mL/只，1 000 g×10 min离心分离血清。

1.2 试验药品与主要仪器

1.2.1 主要试剂

孕酮阴道海绵栓，含35 mg氟孕酮，宁波市三生药业有限公司生产;PMSG，1 000 IU/瓶，宁波市三生药业有限公司生产;绵羊ELISA检测试剂盒FSH（RY-12131）、LH（RY-12111）、P（RY-12074）和E2（RY-12134）均购于上海润裕生物科技有限公司。

1.2.2 主要仪器

酶标仪（Thermo Fisher Scientific，Muhiskanmk3 Inc）美国生产。

1.3 生殖激素的测定

采用ELISA法测定血清中E2、FSH、LH和P的含量。按试剂盒的操作步骤测定D450 nm值，并以D450 nm值为横坐标，含量为纵坐标绘制标准曲线，计算得到回归方程。FSH的回归方程为y=67.352x2+14.563x+2.060，r2=0.994 3;LH的回归方程为y=103.440 0x2+4.297 8x+1.358 9，r2=0991 8;E2的回归方程为y=112.900 0x2+25.900 0x+2191 1，r2=0.988 1;P的回归方程为y=1 773.200x2+3 667.900x-30.839，r2=0.998 7。根据回归方程计算出E2、FSH、LH和P的含量。

1.4 统计分析

E2、FSH、LH和P的含量以（平均数±标准差）表示，使用SPSS 21.0对不同阶段外周血中E2、FSH、LH和P的含量进行方差分析和相关分析，处理0～72 h母羊的发情率进行卡方检验，并进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 孕酮海绵栓+PMSG同期发情处理前后的中国美利奴羊（新疆军垦型）生殖激素含量比较

2.1.1 E2含量 试验羊外周血E2分泌水平在埋栓前1 d最低，为（28.35±8.58） ng/L，埋栓后7 d有较大幅度升高，为（52.95±8.41） ng/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出现回落，含量为（29.95±11.42） ng/L，撤栓/PMSG肌注48 h后升至最高点，为（60.18±5.87） ng/L（表1）。其中撤栓/PMSG肌注48 h后E2分泌水平与埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差异显著（P<0.05）（图1）。

2.1.2 FSH含量 试验羊外周血FSH分泌水平在埋栓前1 d最低，为（21.23±5.54） IU/L，埋栓后 7 d 有所升高，为（25.01±5.00） IU/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出现回落，为（23.57±5.06） IU/L，撤栓/PMSG肌注48 h后升至最高点，为（40.30±307） IU/L（表1）。其中撤栓/PMSG肌注48 h后FSH分泌水平与埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差异显著（P<0.05）（图1）。

2.1.3 LH含量 试验羊外周血LH分泌水平在埋栓前1 d最低，为（18.59±9.25） ng/L，埋栓后7 d有所升高，为（21.01±9.93） ng/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出现回落，为（19.54±6.16） ng/L，撤栓/PMSG肌注48 h后LH分泌水平升至最高点，为（29.37±4.55） ng/L（表1），但与埋栓前1 d、埋栓后7 d和埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差异均不显著（P>0.05）（图1）。

2.1.4 P含量 试验羊外周血P分泌水平在埋栓前1 d最低，为（2 047.38±949.02） pmol/L，埋栓后7 d达到最高，为（3 300.66±861.46） pmol/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）分泌水平下降，为（2 443.59±592.32） pmol/L，撤栓/PMSG肌注48 h后继续降低至（2 182.49±354.31） pmol/L（表1）。其中埋栓后7 d试验羊P分泌水平与埋栓前1 d、埋栓后 13 d、撤栓/PMSG肌注48 h相比均差异显著（P<0.05）（图1）。

从图2可以看出，在埋栓前1 d、埋栓后7 d和埋栓后13 d（撤栓0 h）激素分泌水平个体差异较大，撤栓/PMSG肌注48 h后则达到相对均一水平，均值标准差均以埋栓前1 d为最大，撤栓/PMSG肌注48 h最小，说明在经过孕酮海绵栓+PMSG处理后，试验羊的生殖激素分泌基本达到同步状态。

2.2 同期发情处理的绵羊LH含量与FSH、E2、P含量之间的相关性分析

经统计分析，孕酮海绵栓+PMSG同期发情处理后，中国美利奴羊（新疆军垦型）中外周血中E2、FSH、LH、P含量均呈极显著正相关关系（P<0.01）（表2），其中LH含量与FSH、E2、P含量之间呈中度正相关关系，FSH含量与E2、P含量呈中度正相关关系，E2含量与P含量之间呈低度正相关。

2.3 同期发情处理母羊的发情率

记录孕酮海绵栓处理的母羊在撤栓后72 h发情率，应用卡方检验进行差异显著性分析。中国美利奴羊（新疆军垦型）同期发情处理的总发情率是87.5%，撤栓后>24～48 h同期化程度最高，发情率为70.0%，显著高于0～24 h的7.5%和>48～72 h的10.0%（表3）。

3 讨论与结论

同期发情技术在绵羊繁殖过程中被广泛应用，但影响同期发情的因素很多，导致绵羊发情率存在较大的差别。海绵栓是目前绵羊同期发情中最常用的埋植栓剂，孕酮海绵栓+PMSG肌注法的同期发情处理效果要优于孕酮海绵栓+PG法，孕酮海绵栓与PMSG聯合使用的效果优于单一使用孕酮海绵栓[7]。

Scaramuzzi等检测结果表明，发情期绵羊的卵巢静脉和外周静脉血血浆E2和LH浓度在排卵时显著升高[8]。张寿等发现，青海半细毛羊的E2浓度水平在发情当日最高，而P浓度水平在发情的前1 d、发情的当天和发情后2 d均较低，发情当天的含量最低，发情后10 d浓度上升[9]。赵松华等研究发现，非繁殖季节中国美利奴羊血清中E2含量显著上升[10]。本研究中对孕酮海绵栓+PMSG肌注法处理前后试验母羊外周血生殖激素的ELISA检测，与埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h试验羊外周血中E2含量显著升高（P<0.05），且激素含量的波动范围明显减小，达到相对一致水平，与该时间点的集中发情现象相吻合，表明撤栓48 h前后是中国美利奴羊（新疆军垦型）发情、排卵高峰，本试验结果与孙五洋的结论[11]一致。

Karsch等研究表明，LH峰值出现前48～60 h，黄体开始急剧退化，导致血中P4浓度急剧下降，此时外周血中E2和LH浓度开始缓慢升高，促使垂体释放大量LH而引起排卵[12]。Martineza lvarez等应用不同处理方法诱导母羊发情时，LH峰出现和排卵时间无关[13]。张英杰等研究发现，全年的高繁殖力小尾寒羊血浆FSH和LH浓度均极显著高于低繁殖力和季节性发情的细毛羊[14];LH浓度水平通常在发情期呈现最高峰，FSH有相同的高峰趋势，但不如LH明显[15]。本研究中对孕酮海绵栓+PMSG肌注法处理前后试验母羊外周血生殖激素的ELISA检测，与埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓 0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h试验羊外周血中FSH和LH含量显著升高（P<0.05），且激素含量的波动范围明显减小，达到相对一致水平，与该时间点的集中发情现象相吻合，说明撤栓48 h前后是中国美利奴羊（新疆军垦型）发情、排卵高峰。张振汉等测得双羔组发情日血清E2含量是单羔组的15倍，双羔组母羊在发情日血清LH含量出现峰值后迅速下降，到发情后10 d恢复到发情前1 d的水平，单羔组母羊血清LH峰值出现在发情后1 d[16]。不同动物垂体中FSH/LH的比率及其含量也相同，这与动物的发情时间、排卵时间及发情表现有关[17]。

P的主要作用是“启动”母羊的发情，促使卵巢从相对静止状态转变为活跃状态，从而使母羊正常发情和排卵[18]。Carlson等报道，由于与黄体分泌P相叠加，在母羊血浆中P浓度高于植栓后3 d[19]。Theodosiadou等研究结果表明，高剂量P进行诱导发情处理时，会扰乱羊本身体内激素浓度，导致了较低的妊娠率[20]。Karagiannidis等报道，MPA阴道栓植入阴道后1 d，奶中的P浓度水平上升，然后降到一个稳定的水平直到在撤栓后24 h，P水平降到基础水平[21]。Campbell等报道，植栓的0～1 d P4浓度水平上升，2～3 d P水平下降，9～10 d至撤栓，P维持基础浓度水平[22]。Lazar等报道，血清中P浓度在撤栓后3 h下降[23]。张海容等证明，在乏情期外周血中P浓度保持较低的水平，在15 d有1个波动周期，在发情后24 h E2浓度上升，P浓度下降[24]。侯衍猛等证明，在发情期和间情期血浆内的FSH和LH浓度均呈脉冲式分泌，E2和P为波动式分泌，P在间情期一直维持较高浓度水平[25]。谢炳坤等研究发现，哺乳动物在发情前后有1个较低的P浓度水平，其变化有利于母畜进入下一个发情周期[26]。王金富等对中国美利奴军垦型细毛羊发情周期血清中P浓度进行了检测，结果表明，发情后 1 d P含量显著高于0 d[27]。

本研究对孕酮海绵栓+PMSG肌注法处理前后试验母羊外周血生殖激素的ELISA检测，与埋栓前 1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h试验羊外周血中P含量显著下降，且激素含量的波动范围明显减小，达到相对一致水平，与该时间点的集中发情现象相吻合，说明撤栓48 h前后是中国美利奴羊（新疆军垦型）发情、排卵高峰，P含量在撤栓48 h显著下降，与E2、FSH、LH浓度变化不同，这可能与中国美利奴羊（新疆军垦型）发情配种后妊娠有关。

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收稿日期：2019-07-22

基金项目：国家重点研发计划（编号：2017YFD0501904）;国家绒毛用羊产业技术体系（编号：CARS-40-07）;省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室项目（编号：SKLSGIHP2016A01、SKLSGIHP2017A02）;新疆生产建设兵团科技攻关与成果转化计划（编号：2016AC027）;新疆生产建设兵团重大科技项目（编号：2017AA006）。

作者简介：王晶晶（1995—），女，河南沈丘人，硕士研究生，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail：2318525314@qq.com。

通信作者：万鹏程，博士，研究员，主要从事绵羊繁育与家畜胚胎生物技术研究，E-mail：pengcheng.wan@gmail.com;刘长彬，博士，研究员，主要从事绵羊繁育与家畜胚胎生物技术研究，E-mail：xlchangbin@163.com。