肝细胞癌过继细胞免疫治疗研究进展

李 艳， 严胡铃， 石 瑛， 张 第， 黄孝伦

电子科技大学附属医院·四川省人民医院 细胞移植中心， 成都 610041

肝癌是全球最常见恶性肿瘤之一，据统计[1]全球每年新增肝癌病例数84.1万人，肝癌相关死亡病例数78.2万人，其中约50%来自中国，极大的增加了社会经济负担。肝细胞癌(HCC)、胆管细胞癌以及两者的混合型癌是原发性肝癌的三种主要常见类型，其中以HCC最为多发，大约占原发性肝癌的80%～90%。HCC的具体发病机制尚不明确，既往研究提示其致病因素包括病毒性肝炎、酒精性肝硬化、非酒精性脂肪性肝硬化等。目前针对HCC的临床治疗还是以手术切除为主，并根据患者病情考虑介入、消融、放疗、化疗等综合治疗方案。肝癌早期诊断的局限性和术后复发率高等因素都限制了肝癌切除术的临床获益。一项对1330例HCC患者手术切除治疗后的跟踪研究发现，肝癌切除术后5年生存率为36.9%[2]；而其5年复发率却高达70%[3]。因此，急需开发新的个体化治疗方案，以改善患者生存率。

近年来，随着对肝癌组织结构及免疫微环境认知的深入，免疫治疗逐渐成为HCC治疗研究的热点。肿瘤的免疫治疗是指直接或间接调动机体免疫系统杀灭肿瘤细胞，根据其作用方式不同，可分为免疫监测点抑制剂、免疫疫苗以及过继细胞免疫疗法等。过继细胞免疫治疗是指通过体外扩增培养具有肿瘤杀伤作用的免疫细胞，再将其回输到肿瘤患者体内达到抗肿瘤目的的一种被动免疫治疗方法。根据免疫细胞对肿瘤的靶向特异性不同可将其分为非特异性肿瘤杀伤免疫细胞和特异性肿瘤杀伤免疫细胞。具有非特异性肿瘤杀伤作用的免疫细胞包括细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)和自然杀伤细胞(NK细胞)；而具有特异性肿瘤杀伤作用的免疫细胞包括树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cells and cytokine-induced killer cells，DC-CIK)、肿瘤浸润性T淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)以及嵌合抗原受体T淋巴细胞(chimeric antigen receptor T-cells，CAR-T)。本文就这几种过继免疫细胞治疗HCC的研究现状及临床研究进展进行简单综述。

1 非特异性肿瘤杀伤免疫细胞

1.1 细胞因子诱导杀伤细胞(CIK) CIK是通过细胞因子体外刺激外周单核细胞扩增而得到的一类异质性混合淋巴细胞群，主要包括NK样T淋巴细胞(NKT细胞)、细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞[4]。NKT细胞是发挥抗肿瘤活性的主要效应细胞，作为固有免疫应答中的一员，其主要是通过释放细胞因子或激活Fas/FasL、NKG2D等途径发挥非特异性肿瘤杀伤作用。NKT细胞在外周单核细胞中占比较少，但在经体外细胞因子刺激后可扩增到原来的1000倍左右[5]，这就增加了CIK过继免疫治疗的可行性。最新研究[6]指出CIK中NKT细胞占比可作为预测CIK治疗肝切除术后HCC患者预后的重要指标。

鉴于CIK的广谱抗肿瘤特性，其已被广泛研究用于治疗临床肿瘤患者。目前，已有许多临床试验证明CIK过继细胞免疫治疗在晚期或一线治疗无效的肿瘤患者中的可行性和有效性。一项多中心Ⅲ期临床试验[7]结果表明，CIK治疗能将HCC患者的无进展生存期延长至44个月，随后的5年随访结果显示，相比于对照组(未经CIK辅助治疗)，HCC患者的无进展生存期和总生存期都得到了有效延长[8]。然而，近期一项临床研究[9]报道却指出CIK治疗在改善HCC患者无进展生存期的同时并没有明显提高患者的总生存期。而导致该矛盾产生的原因除了各自临床设计以及患者纳入标准等有所不同以外，基于其分子机制，一方面由于CIK是通过细胞因子刺激外周单核细胞而得到的，不具备肿瘤特异性靶向杀伤作用，抗肿瘤活性较弱；另一方面则是因为肝脏“免疫特赦”的特点，HCC患者的肿瘤免疫微环境处于抑制状态，使回输的CIK耗损较多。Yu等[10]研究发现，CIK能增加肿瘤中免疫抑制细胞的浸润，从而抑制CIK自身的抗肿瘤活性。由此可见，CIK治疗并不能使所有的HCC患者从中获益。

基于以上研究结果，将CIK与其他治疗方法联用可能有助于增强CIK疗法的有效性。I125放射粒子植入是肿瘤放射治疗的一种方法，其可以达到局部杀伤肿瘤的效果。CIK联合I125放射粒子植入治疗肝癌小鼠的研究[11]表明，联合治疗能有效抑制肿瘤的生长。免疫监测点抑制剂通过阻断免疫监测点信号通路来阻止肿瘤细胞发生免疫逃逸，增加免疫细胞对肿瘤细胞的识别及杀伤作用。Huang等[12]通过降低肝癌细胞中程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)表达可以改善CIK对肝癌细胞的敏感性，增加其抗肿瘤活性。由此可见，未来CIK免疫治疗HCC的临床研究重点可转向联合治疗，有望使更多的HCC患者从中获益。

1.2 NK细胞 NK细胞是人体固有免疫中最重要的免疫细胞之一，其可以在不受抗原致敏的情况下发生非特异性免疫应答。NK细胞的活化状态由NK细胞表面抑制性受体(NKG2A、KIR、LIR-1等)和活化性受体(NKG2D、NKp30、NKp80等)表达的动态平衡决定。根据NK细胞表面CD56表达表型不同将其分为CD56DimNK和CD56BirghtNK细胞，外周循环中90%的NK细胞都是CD56BirghtNK细胞，主要通过细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞；而CD56DimNK细胞主要存在于组织中，通过释放细胞因子调节T淋巴细胞功能发挥间接抗肿瘤效应。肝脏是人体NK细胞最大的储存场所，但肝癌中的NK细胞由于免疫抑制微环境往往处于功能性衰竭状态，最近有研究[13]指出，去乙酰化酶-2能重新激活肝癌小鼠肿瘤中衰竭NK细胞的抗肿瘤活性。因此，通过外源加入具有抗肿瘤活性的NK细胞，重塑肝脏的免疫系统，有望延缓肝癌患者的生存时间。

NK细胞的免疫活性并不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制，因此用于过继免疫治疗的NK细胞来源较广。根据NK细胞来源可将NK细胞过继免疫疗法分为自体NK细胞免疫疗法和同种异体NK细胞(CD34+造血干细胞、NK92细胞等)免疫疗法。自体NK过继免疫细胞是用细胞因子刺激外周单核细胞中CD56BirghtNK细胞的体外扩增得到的，研究[14]发现经细胞因子刺激后能将外周血中NK细胞扩增到原来的140倍左右，并表现出对肝癌细胞的细胞毒性作用。Parkhurst等[15]首次将自体NK细胞用于治疗8例晚期黑色素瘤和肾癌患者的临床研究结果表明，NK细胞可在肿瘤患者外周中持续停留1个月之久，但并没有表现出明显的临床疗效；随后的一项Ⅰ期临床研究结果也表明自体NK细胞的临床疗效甚微[16]。从分子水平上分析，肿瘤细胞表面往往高表达与自身NK细胞表面相匹配的NK细胞表面抑制性受体(inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)使肿瘤细胞极易发生免疫逃逸。由此便促进了同种异体NK细胞过继免疫治疗的发展。Miller等[17]通过肿瘤细胞表面和同种异体NK细胞表面KIR的不同匹配程度预测NK细胞的临床疗效，结果显示，在KIR不匹配的肿瘤患者中有75%获得了完全缓解；而在KIR匹配的情况下，只有13.3%的患者获得了完全缓解，说明与肿瘤KIR受体不匹配的同种异体NK细胞具有更好的临床疗效。一项针对KIR错配的同种异体NK细胞治疗HCC的临床结果初步提示NK细胞能在短期内提高HCC患者的免疫功能，改善患者的生活质量[18]。

以上的研究结果表明，具有广谱抗肿瘤效应的NK细胞只能在短期内使部分HCC患者从中受益。一方面，NK细胞缺乏有效的肿瘤特异性靶向作用，抗肿瘤活性弱；其次，肝癌的免疫抑制微环境抑制了回输的NK细胞的免疫活性。据此，有临床研究将同种异体NK细胞免疫治疗和其他肝癌治疗方法联用以期加强NK细胞免疫治疗的临床疗效。不可逆电穿孔技术是一种创伤小、周期短的肿瘤治疗方法，研究[19]发现，不可逆电穿孔技术和同种异体NK细胞联合治疗能有效改善晚期HCC患者的免疫状态，延长患者的无疾病进展期和总生存期。最近1例个案报告[20]在HCC患者接受肝移植后复发的情况下，采用同种异体NK细胞联合I125粒子植入治疗有效地改善了该例患者的肝功能，明显观察到了肿瘤的消退。以上结果均提示NK细胞的联合治疗有望使更多的HCC患者从中受益。

2 特异性肿瘤杀伤免疫细胞

2.1 树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK) 作为抗原递呈能力最强的专职抗原递呈细胞，DC细胞通过识别、加工肿瘤抗原，形成抗原-MHC复合物表达于细胞表面供T淋巴细胞识别，促进幼稚T淋巴细胞成熟。研究表明，肝癌免疫抑制微环境中的DC细胞处于功能性耗竭状态。因此，有研究人员提出将负载有肿瘤抗原的DC细胞回输到患者体内，补充肝癌中功能性耗竭的DC细胞，重新激活肝癌中的免疫细胞以增强机体的抗肿瘤免疫反应。但临床研究[21]结果显示，与对照组(接受支持治疗)相比，DC细胞只能使13%的晚期HCC患者获得部分缓解，可见其临床疗效甚微。究其原因，可能是肝癌中T淋巴细胞活性处于被抑制的状态，难以在免疫抑制微环境下被重新激活。DC细胞治疗的局限性进一步促进了DC-CIK治疗的研究。一方面，DC细胞可通过将肿瘤抗原递呈给CIK，促进CIK成熟，增加其肿瘤特异性靶向杀伤作用；另一方面，DC细胞本身就可释放细胞因子发挥间接的抗肿瘤效应。DC-CIK治疗肝癌小鼠的初步研究[22]结果证明其能增加体内细胞毒性T淋巴细胞的数量，抑制肿瘤生长。

随着对DC-CIK抗肿瘤活性基础研究的深入，DC-CIK过继免疫治疗HCC的研究逐渐转向临床。近期一项Meta分析[23]比较了DC细胞、CIK和DC-CIK治疗晚期HCC患者的临床疗效，发现DC-CIK治疗HCC患者的总生存期高于DC细胞和CIK单独治疗。但由于肝癌的免疫抑制微环境，DC-CIK的免疫活性部分被抑制而导致其远期疗效有限，基于此，目前有更多的临床研究尝试将DC-CIK免疫治疗同其他肿瘤治疗方法联合，以期通过改善肝癌的免疫抑制微环境增加DC-CIK的抗肿瘤活性。索拉非尼是美国食品药品监督管理局批准用于HCC治疗的一线靶向药，据一项Ⅲ期临床试验[24]结果表明，索拉非尼能将HCC患者的中位生存时间延长至12.3个月，但随后的研究表明索拉非尼在短期内极易产生耐药。Zhou等[25]将索拉非尼联合DC-CIK过继免疫治疗晚期HCC患者，与单独治疗相比，联合治疗将HCC患者的中位生存时间延长了约5个月。经肝动脉化疗栓塞术(TACE)是不能手术切除的中晚期HCC患者或术后进行辅助治疗的一种常用介入治疗方法，其副作用的病死率极高，同时难以达到全身性治疗效果而限制了其在HCC治疗中的广泛应用。对接受过TACE治疗的HCC患者辅以DC-CIK治疗的临床研究数据进行统计发现，DC-CIK治疗组患者的无进展生存率和总生存率均高于单独TACE治疗组[26]；同时，有研究[27]指出DC-CIK对PD-L1低表达并接受过TACE治疗的HCC患者治疗效果最佳，提示PD-L1可能作为预测接受过TACE治疗后再行DC-CIK治疗临床疗效的关键因子。HBV感染是HCC发展过程中的主要危险因素，因此有效预防HBV感染可以降低HCC的发病率。将负载有HBsAg的DC细胞与CIK细胞共培养后用于治疗慢性乙型肝炎，能有效降低患者HBV病毒滴度，提高宿主对病毒的免疫应答，提示HBsAg-DC-CIK治疗能增强乙型肝炎患者的免疫功能，预防HCC的发生[28]。另一项Ⅰ期临床试验结果证明DC-CIK治疗后约57%的HCC患者体内HBV病毒载量都有所降低[29]。以上临床研究结果表明DC-CIK在抑制肝癌生长的同时还能降低肝癌患者体内HBV病毒滴度，有望降低HCC的复发率。但后续仍然需要更多的临床试验进一步证明其临床有效性和安全性。

2.2 肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL) 肿瘤浸润性淋巴细胞是存在于肿瘤间质中的一类异质性淋巴细胞群，包括CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、NK细胞以及各种免疫抑制细胞如：调节性T淋巴细胞等。TIL过继免疫疗法即是通过细胞因子刺激经肿瘤组织“驯化”后具有特异性抗肿瘤活性的CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞在体外的克隆性增殖，再回输给肿瘤患者体内，被动增强肿瘤患者免疫功能的一种治疗方法，其中以发挥主要抗肿瘤效应的CD8+T淋巴细胞居多[30]。CD8+T淋巴细胞可通过其表面T淋巴细胞抗原受体与肿瘤抗原识别而释放颗粒酶、激活Fas/FasL途径促进肿瘤细胞凋亡，或通过释放细胞因子等发挥直接或间接的抗肿瘤效应；而CD4+T淋巴细胞则在促进CD8+T淋巴细胞成熟的过程中发挥着重要的作用。

由于不同肿瘤组织结构不同，分离扩增TIL的难易程度也不同。通过比较黑色素瘤不同转移部位的肿瘤组织中TIL分离的难易程度发现肺转移来源的肿瘤组织分离扩增出TIL的成功率最高[31]。分离TIL的常规步骤包括：(1)TIL初次扩增阶段，将肿瘤组织剪成碎片，加入含有IL-2的完全培养基培养于24孔板中，大约2～4周即可收集细胞；(2)TIL快速扩增阶段，收集第一个扩增阶段中聚集生长的TIL培养于含有IL-2、抗CD3单抗的完全培养基中进行第二次扩增，约14 d后收集细胞。常规方法分离扩增TIL的成功率并不高，不能在短期内使TIL数量达到临床数量级。研究[32]表明，生物反应器可以实现体外大量TIL的扩增，但并不是每个实验室都有条件使用生物反应器。随后，有研究[33]通过对普通培养瓶结构进行改造，制得的G-Rex透气培养瓶能使细胞更好的利用培养基中的营养物质，减少有害物质对细胞的损伤，实现了在实验室条件下获得临床数量级TIL的目的，目前该透气瓶已广泛应用于TIL等免疫细胞的体外大量扩增。

体内外实验均证明，TIL能分泌高水平IFNγ、IL-2等细胞因子[34]，通过瘤内注射TIL可使荷瘤小鼠缓解率达到40%[35]。但自从1986年Rosenberg等[36]首次报道提出从肿瘤组织中分离扩增的TIL具有抗肿瘤活性以来，大部分临床研究均围绕黑色素瘤展开。一项Ⅱ期临床试验对22例转移性黑色素瘤患者行自体TIL治疗后有35%的患者出现客观缓解，其中1例发生广泛肝转移的患者在治疗后完全缓解时间达21个月以上[37]，近期的一项Ⅱ期临床试验结果也表明自体TIL能将转移性黑色素瘤患者的总体中位生存时间延长至6.2个月[38]。相比之下，TIL应用于HCC中的临床研究则较少。一方面可能由于肝脏组织结构较为紧密，分离扩增TIL难度相对较大；另一方面，HCC肿瘤免疫抑制微环境削弱了部分TIL的抗肿瘤活性。一项Ⅰ期临床试验[39]将自体TIL应用于治疗8例经手术切除治疗后的HCC患者，持续给予细胞治疗16个月，其中只有1例(12.5%)复发，与对照组(未给予TIL治疗或其他免疫治疗)6、12个月的复发率(19%、42%)相比，TIL治疗明显降低了HCC患者手术切除后的复发率。以上的临床结果初步显示了TIL治疗HCC的临床有效性，后续可着眼于改变HCC肿瘤免疫抑制微环境及TIL分离扩增方法的优化，以期能让更多的HCC患者从中获益。

2.3 嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T) CAR-T是将靶向特异性肿瘤抗原单抗的scFv段与CD3基因序列重组并导入T淋巴细胞中形成具有肿瘤特异性靶向杀伤作用的免疫细胞，并通过其scFv段与肿瘤抗原识别，诱导胞内CD3激活，刺激T淋巴细胞释放炎性因子等实现对肿瘤的特异性杀伤作用。CAR-T发展至今共经历了四代：第一代是将肿瘤抗原单抗的scFv段与CD3基因序列重组形成的CAR-T；第二代CAR-T是在第一代基础上增加了共刺激信号CD28的表达，其抗肿瘤效应明显优于第一代；第三代CAR-T则增加了两个或两个以上共刺激信号表达，其抗肿瘤效应和细胞增殖能力都有所提高，但其毒副作用也在增加；第四代CAR-T则是增加了细胞因子的共表达，进一步强化了CAR-T的免疫应答。

影响CAR-T治疗的关键因素是肿瘤抗原的选择，靶向的肿瘤抗原需要具有肿瘤特异性以达到靶向杀伤肿瘤的目的。目前靶向HCC的肿瘤抗原有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、甲胎蛋白(AFP)、CD147、癌胚抗原，其中以GPC3研究最多。GPC3是锚定于细胞膜上的跨膜蛋白，在细胞的生长发育中发挥着重要的作用，GPC3在HCC中特异性高表达使其成为HCC治疗的理想靶点。Gao等[40]首次评估了Anti-GPC3 CAR-T细胞对GPC3表达不同的肝癌细胞的杀伤能力，结果表明其能有效杀伤GPC3+的肝癌细胞，且其抗肿瘤效应与GPC3表达量呈正比，随后的动物实验也证明其对原代肝癌组织的抗肿瘤活性[41]。肝癌免疫抑制微环境中免疫抑制因素的存在可能会削弱CAR-T的抗肿瘤活性，如：PD-1/PD-L1信号通路等。研究通过在CAR结构中增加抗PD-1单抗的表达[42]或运用CRISPR/CAS9技术敲除受体T淋巴细胞中PD-1的表达[43]阻断PD-1/PD-L1信号通路均能增加Anti-GPC3 CAR-T对GPC3+/PD-L1+肝癌细胞的抗瘤活性。通过在CAR重组基因中增加细胞因子的表达，不仅能促进CAR-T的成熟，增加其抗肿瘤活性，还能发挥细胞因子本身的免疫调节功能，达到双重抗肿瘤的效果。近期Liu等[44]在Anti-GPC3 CAR-T中增加IL-12的表达不仅能有效裂解GPC3+的肝癌细胞，还能抑制荷瘤小鼠中调节性T淋巴细胞的免疫活性。Batra等[45]通过在CAR结构中增加细胞因子IL-15和IL-21的表达，能刺激CAR-T在体内外的快速增殖，使其在动物体内具有强而持久的抗肿瘤效应，这为开展共表达IL-15和IL-21的Anti-GPC3 CAR-T细胞治疗HCC的临床研究提供了理论基础，目前该项研究已成功申请了Ⅰ期临床试验(NCT04093648)。2018年在Nature上发表的一篇研究[46]通过在CAR-T中增加细胞因子IL-7和CCL19的表达，能增加DC细胞和T淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润，间接增强CAR-T的抗肿瘤活性，随后该研究的有效性也在肝癌细胞中得到了证实[47]。目前Anti-GPC3 CAR-T治疗HCC的研究还仅限于动物实验，但已有多项Anti-GPC3 CAR-T治疗HCC的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在研究当中(表1)。

表1 靶向GPC3的CAR-T治疗HCC的临床研究

AFP的异常表达是作为诊断HCC的常用生化指标。与GPC3不同，AFP是一种胞内合成的分泌蛋白，不表达于细胞膜上，无法实现抗体与肿瘤抗原的直接识别，限制了其在作为靶向抗原治疗HCC中的应用。因此Liu等[48]将MHC-AFP作为CAR-T的靶向抗原，经瘤内注射后约有75%的肝癌小鼠肿瘤出现完全消退。目前有关CAR-T的临床研究仍以恶性血液类肿瘤居多，近期一项Ⅰ/Ⅱa期临床试验共纳入15例淋巴瘤和白血病患者，其中有6例(40%)在经自体Anti-CD19 CAR-T治疗后出现完全缓解[49]，证明了Anti-CD19 CAR-T治疗血液类恶性肿瘤的临床可行性和安全性。且美国食品药品监督管理局已批准自体Anti-CD19 CAR-T用于临床治疗急性粒细胞白血病[50]。而对于HCC而言，由于强免疫抑制微环境，特异性肿瘤抗原缺乏等原因都限制了CAR-T在HCC治疗中的临床获益。因此还需要不断对肝癌的免疫抑制微环境机制进行深入探讨，寻找肝癌特异性更强的靶点，以期使HCC患者也能从CAR-T治疗中获益。

3 小结

用于过继免疫治疗的免疫细胞都具有其各自的优缺点(表2)。尽管过继细胞免疫治疗在HCC的治疗方面展现出了巨大的潜能，但目前仍然有许多问题亟待解决：(1)HCC中强免疫抑制微环境往往会削弱过继免疫细胞的抗肿瘤活性；(2)制备过继免疫细胞的周期较长，难以在短时间内获得临床数量级的免疫细胞；(3)回输的细胞量以及各种质控标准尚无统一的规范等。因此如何在体外通过更简单的方法在短时间内获得临床数量级具有特异性肿瘤杀伤效应的免疫细胞将是今后HCC过继细胞免疫治疗研究的重点方向。相信在不久的将来，过继细胞免疫治疗将成为临床上HCC治疗可供选择的另一方法。

表2 用于过继细胞免疫治疗的免疫细胞在HCC治疗中的优缺点