利用CRISPR/Cas9系统快速建立APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型

王海 申及 邹小冬 杨钦钦 张永乐 呙登俊

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人常见的慢性退行性神经系统疾病，其两大病理特征为老年斑和神经原纤维缠结，同时出现大量神经突触丢失和炎症反应所导致的神经元变性[1]。目前AD的病因、发病机制还不是十分明确，主要障碍之一是传统构建AD动物模型的技术还不够完善。APP/PS1双转基因小鼠是目前国际较为认可的AD动物模型[2]，是AD药效学评价的金标准,但锌指核酸酶和胚胎干细胞打靶等传统技术构建的APP/PS1双转基因小鼠流程繁琐，耗时较长，费用高，一定程度上制约了该模型的广泛应用。近年来一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的CRISPR/Cas9技术快速发展[3]，其特异度高、分子构建简单、流程短，可以克服传统构建转基因动物模型技术的构建模型造价昂贵、成模周期较长的不足。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠模型，以期为开展AD的病因治疗提供载体，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 选择美国癌症研究所（institute of cancer research，ICR）品系假孕雌性小鼠10只，6～7周龄，体重22～26 g，C57BL/6品系野生雌性小鼠30只、雄性小鼠20只，4～5周龄，体重15～18 g。均购自南京大学模式动物研究所，在无特定病原体动物（SPF）级环境适应性饲养3d，实验操作严格遵守国际动物保护与使用指南的相关规定，单位动物实验使用许可证号:SYXK（浙）2019-0010。朊蛋白（prp）、APPswe和PS1dE9基因合成根据哺乳动物进行密码子优化的Cas9 RNA和sgRNA的转录模板质粒以及引物合成均为南京尧顺禹生物科技有限公司提供。使用mMESSAGE mMACHINET7 Kit（AM1344）、MEGA shortscriptTMT7 Transcription Kit（AM1354），均购自美国Life Technologies公司。T7 Transcription Kit的回收试剂盒MEGAclear Transcription Clean-Up Ki（tAM1908）购自美国Invitrogen公司。CRISPR/Cas9活性检测试剂盒（20180605MN）购自北京合生基因科技有限公司；Taq DNA聚合酶、Pyrobest高保真聚合酶、DNA连接酶、基因组提取试剂、DNA marker、dNTP、PCR 缓冲液、蛋白酶 K、BbsI、BamH Ⅰ、BglⅡ酶、溶菌肉汤（Luria-Bertani，LB）培养基、分解代谢抑制作用的超优肉汤（super optimal broth with catabolite repression，SOC）培养基均购自北京百奥莱博科技有限公司。7500型PCR仪购自美国ABI公司，核酸琼脂糖凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司，96孔板发光检测仪购自美国Promega公司，X-22R低温高速离心机购自美国Allegra公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA活性检测 在美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站上查找APPswe/PS1dE9基因的编码区序列（coding sequence，CDS）区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。根据基因本身的性质，选择小鼠11号染色体上H11作为插入位点，选取长度为250 bp的序列，使用在线预测软件（http：//crispr．mit．edu/）进行 sgRNA设计，在可供选择的30个sgRNA中，为了确保sgRNA切割基因的有效性，选取其中评分最高即脱靶效应概率最低的3个sgRNA，采用CRISPR／Cas9活性检测试剂盒进行活性检测，选出体外相对活性值最高的sgRNA。（1）构建sgRNA载体：将sgRNA上下游引物（引物见表 1），配制为 100 μmol/L 浓度，分别取 1 μl，与0.5 μl T4 连接酶、1 μl T4 连接酶 buffer及 ddH2O 配制成连接体系，使用PCR仪设置37℃30 min、95℃5min，然后以5℃/min的速度缓慢下降到25℃。使用BbsI内切酶将1 μg px330载体于37℃酶切30 min。取退火后引物1 μl与线性化的px330载体室温连接2 h。将连接产物加入100 μl感受态细胞中，冰上放置20 min，42℃热激60 s，加入SOC培养基于37℃培养45 min后涂布于平板。次日挑克隆接种于LB培养基中，培养8 h后提取质粒并送测序。（2）提取小鼠DNA，使用引物H11f、H11 r（引物见表1），从野生型小鼠基因组中进行切割位点高保真酶的PCR扩增；连接到pUCA载体，克隆提取并测序验证。将293 T细胞铺种于96孔板中，将sgRNA质粒（待测sgRNA及试剂盒中提供阳性对照sgRNA）90 ng/孔，切割位点质粒10 ng/孔进行混合，加入PEI转染试剂1.2 μl混匀。室温放置15 min后加入96孔板中。37℃，5%CO2：培养24 h后采用Promega 96孔板发光检测仪检测荧光强度。每个sgRNA进行3次独立实验，通过将荧光值与试剂盒中提供的阳性对照荧光值进行比较。

1.2.2 含有APPswe和PS1dE9同源重组序列载体的构建 商业合成prp、APPswe及PS1dE9序列，中间以T2A序列相连接，两侧设计双酶切位点。含有APPswe和PS1dE9同源重组序列的载体（prp-APPswe-bGHPAT2A-PS1dE9-SV40PA Donor）主要包括6个元件：3.5 Kb的prp基因启动子、2.0 Kb的APPswe、bGHPA和T2A连接元件、1.3 Kb的PS1dE9和1.0 Kb的转录终止子SV40 polyA（图1），商业化合成含有APPswe和PS1dE9同源重组序列的载体后进行酶切验证序列。

1.2.3 F2代小鼠构建 （1）20只C57BL/6品系野生雌性小鼠，在5～6周进行超数排卵。腹腔内注射5 IU的孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG），然后约46～48 h后再注射5 IU的人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），12 h后诱发排卵；随后与10只同品系雄鼠合笼配种，次日清晨检栓，显微注射当日，通过断颈快速处死见栓0.5 d的小鼠，从输卵管膨大部中取出受精卵备用。（2）显微注射前1 d用10只发情期ICR雌性小鼠与10只结扎C57BL/6品系雄性小鼠按照1︰1比例合笼，显微注射当天早晨取出雌鼠查看阴道栓，将见栓的雌鼠作为假孕雌鼠备用。（3）将有活性的sgRNA、Cas9 RNA和含有目标同源重组序列的载体经显微双注射或单注射于100枚小鼠的受精卵中，将注射后存活的受精卵移植于假孕雌鼠的输卵管中，获得F0代小鼠，在其出生9 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，提取基因组DNA，对F0代小鼠基因型进行鉴定，获得F0代阳性小鼠；（4）将F0代阳性小鼠再与C57BL/6野生小鼠交配，从而获得F1代小鼠。将F1代小鼠出生9 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，提取基因组DNA，对F1代小鼠基因型进行鉴定。对鉴定得到的F1代杂合子小鼠，选择来自同一只F0代小鼠基因型一致的F1代杂合子小鼠，达到性成熟后进行同胞交配，获得F2代小鼠。此外，所有小鼠饲养结束后，麻醉处死进行取材的同时，剪取鼠尾（3～5 mm）进行重新鉴定基因型；两次鉴定结果进行比较，统计数据时剔除基因型假阳性小鼠的数据。

表1 PCR反应引物序列

1.2.4 APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠基因型鉴定及获得 F2代小鼠尾及剪趾基因组DNA经PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，为使PCR检测特异，设立阴性对照（PCR时的空白管，除了模板不加之外，其成分与其他管一样）和阳性对照（Marker）。针对人APP、PSl基因合成特异性引物，APP扩增片段长度为344 bp，PS1片段长度为 608 bp：（1）APP 扩增引物为：Sense 5′GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG 3；Anti sense 5′CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG 3′。（2）PS1 扩增引物 为 ：Sense 5′AATAGAGAACGGCAGGAGCA 3′，Anti sense 5′GCCAGAGGGCACTAATCAT 3′，反应条件：95 ℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳。若在344 bp、608 bp处可见有一条明亮的带，与目的基因片断的预期位置相符，说明 APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠构建成功。

图1 小鼠H11位点及含有APPswe和PS1dE9同源重组序列的载体构建图

1.2.5APP和PS1在APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠和同窝野生型小鼠脑组织中蛋白表达水平检测 在APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠和同窝野生型小鼠6月龄时，将其麻醉处死，取脑组织分别进行Western blot，检测APP和PS1的活性和表达水平，同时分别以β-Actin和GAPDH为内参进行定量。如果APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠的APP和PS1表达均明显高于同窝野生型小鼠，表明构建的APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠可以将APP和PS1基因稳定遗传给后代。

2 结果

2.1 sgRNA活性 见图2。

图2 sgRNA体外相对活性

由图2可见，3组sgRNA中sgRNA1相对活性最高，为（65.30±12.31）%，sgRNA 评分及脱靶分析见图3。

2.2 prp-APPswe-bGHPA-T2A-PS1dE9-SV40PA Donor分析结果 经BamHⅠ、BglⅡ酶切得到约6 300 bp、2 150 bp的片段和约1 500 bp、6 600 bp的片段，结果符合预期,说明成功构建了含有目标同源重组序列的载体。

2.3 F2代小鼠的获得 F0代小鼠18只，基因型鉴定得到 4只 F0阳性小鼠（分别为 5#、11#、14#、17#，2雄 2雌）；F1代小鼠26只，基因型鉴定筛选出10只F1代杂合子小鼠；F2代小鼠27只。

2.4 PCR鉴定结果及APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠的获得 见图4。

由图4可见，得到的27只F2代小鼠，通过PCR鉴定基因型；l# 和 7# 来源于 F0 代小鼠 5#，6#、8#、9#来源于F0代小鼠17#，在344bp、608bp处可见扩增目的条带，说明成功构建5只APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。

2.5 APP和PS1在小鼠脑组织中的蛋白表达水平 见图5。

由图5可见，APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠模型的APP和PS1的表达均明显高于同窝野生型小鼠。

3 讨论

据估计2050年全球每85人中将有1例AD患者，AD已成为全球公共卫生的一个严重威胁[4]。AD的发病过程十分复杂，是年龄、生活环境与遗传因素共同作用的结果，非转基因动物模型大多只是对疾病症状的模仿，尽管可能存在部分特征性病理改变，但是均不能模拟人类AD渐进性的神经系统退行性改变。日趋成熟的转基因动物技术可以以疾病的遗传学为基础，在活体上研究某一特定致病基因的作用[5]，能够模拟疾病的主要病理特征以及行为改变的特点，具备构建动物模型的实验周期短、成本低的特点[6]，已经成为了近年研究的热点，有望成为研究AD发病机制及相关药物研发的理想工具。

图3 sgRNA评分及脱靶分析

图4 APP/PSl双转基因AD小鼠PCR鉴定电泳图（N：阴性对照；P：阳性对照）

图5 双转基因小鼠脑组织中APP和PS1表达电泳图（WT为野生型小鼠，1#、6#、7#、8#、9# 分别代表双转基因阳性小鼠）

CRISPR/Cas9系统具有序列特异性的DNA切割机制，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链 RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的[7]。H11位于小鼠11号染色体，是位于eif4enif1与drg1两个基因之间的一个位点，于2010年由Hippenmeyer S发现，整合到H11位点的外源基因可以稳定高效的表达[5]。选择H11作为插入位点，在此位点的插入基因不会影响其他基因表达，是一个安全区域，同时此插入基因的表达也不会受到周边区域的影响。采用CRISPR/Cas9技术进行DNA大片段敲入定点插入需要以下两个步骤，首先在靶点特异性sgRNA的引导下，Cas9核酸内切酶结合到基因组上的具体靶点，产生双链断裂，迫使细胞进行紧急修复，随后采用抑制非同源重组方式，让细胞偏好同源重组修复路径，使目的片段得到基因定点插入[9]。因此，高效率同源重组的先决条件是得到能够高效切割的sgRNA[10]。

在本研究中，确定H11位点作为敲入位点，设计并验证sgRNA的切割效率，选择体外相对活性为（65.30±12.31）%的sgRNA；本研究选择的高效sgRNA与吴曦等[11]研究实验筛选得到的针对H1l位点通用型sgRNA是一致的。采用CRISPR/Cas9系统，选择H11作为插入位点，将高效的sgRNA、Cas9 mRNA和含有目标同源重组序列的载体显微注射入C57BL/6品系小鼠的受精卵中，获得基因修饰的原代小鼠；再与野生小鼠交配获得双转基因F1代小鼠，再进行同胞交配，最终获得5只APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。采用PCR方法鉴定双转基因鼠的基因型，出现约344 bp和608 bp的目的基因条带，表明成功构建出转入APPswe/PS1dE9序列的APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠（图5）；可以将转基因APP和PS1稳定遗传给后代，以建立APPswe和PS1dE9过表达APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠家系。采用Western blot检测APP和PS1在脑组织中的蛋白水平表达，结果显示APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠的APP和PS1的表达均明显高于同窝野生型小鼠。由于本研究尚处于动物模型构建初步研究阶段，实验方案还不够完善，未对双转基因AD小鼠模型进行进一步的行为学观察和病理学观察，下一步工作将采用Morris水迷宫隐蔽平台实验观察双转基因AD小鼠空间学习和记忆能力，麻醉处死后取双转基因AD小鼠脑组织行HE染色和抗Aβ1-17抗体的免疫组织化，观察小鼠海马结构以及神经元形态变化，对构建的双转基因AD小鼠进行进一步鉴定。

综上所述，利用CRISPR/Cas9系统可以使目的片段得到基因定点插入，成功构建的APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠，可以为开展AD的病因治疗提供载体。