lncRNA PVT1及miR-26b在增生型糖尿病视网膜病变患眼玻璃体、增生膜中的表达研究

2020-09-04 09:25隋文婕张晶晶汤庆丽陈鑫唐于荣
临床眼科杂志 2020年4期
关键词:玻璃体微血管视网膜

隋文婕 张晶晶 汤庆丽 陈鑫 唐于荣

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是一种由血糖升高引起的视网膜微血管损伤类疾病,属于糖尿病并发症。近年来,DR发病率呈较高水平且逐年上升[1]。DR患者主要症状有视网膜前出血、视网膜脱离、不同程度视力障碍等,若病情不能得到及时控制,DR可能发展为有新生血管形成的增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。PDR可加剧患者视网膜出血,引发视网膜脱离等其它增生型病变,严重影响患者健康[2]。有研究表明,上皮间充质转化过程(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是影响PDR进展中新生血管形成关键因素[3]。Shen等在宫颈癌中研究发现,长链非编码RNA 浆细胞瘤变异易位基因1(long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation,lncRNA PVT1)可通过调节EMT,影响癌细胞增殖[4]。有研究表明,微小RNA-26b(micro RNA-26b,miR-26b)在胶质瘤细胞中显著下调,可参与调控替莫唑胺耐药介导的EMT过程[5]。由于lncRNA PVT1和miR-26b在PDR中表达水平及意义尚不清楚,本研究通过检测PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1和miR-26b表达水平,分析与相关临床指标相关性,探讨二者与PDR进展关系,为进一步深入研究PDR相关影响机制和临床诊治提供一定帮助。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年3月至2019年3月本院收治的单眼发病的PDR患者58例为研究对象(PDR组)。其中男性31例,女性27例,年龄41~75岁,平均年龄(53.29±16.31)岁。根据中华医学会眼科学分会眼底病学组诊断标准[6],将入组PDR患者分为:Ⅴ期33只眼,Ⅵ期25只眼。纳入标准:①确诊为2型糖尿病引起的PDR病变;②需行患眼玻璃体切除术;③临床资料完整。排除标准:①有其他眼部手术史;②合并患有高血压;③合并患有恶性肿瘤及其他器官重大疾病者。另选取同期因特发性黄斑裂孔行玻璃体切除术患者35例作为对照组。其中男性19例,女性16例,年龄40~73岁,平均年龄(52.87±15.64)岁。对照组均为单眼发病,排除伴有恶性肿瘤、高度近视及其他眼部疾病、免疫系统及感染性疾病患者。所有入组者对本研究知情并签署知情同意书,本研究经本院伦理委员会批准同意。

二、主要仪器和试剂

实时荧光定量(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)仪(型号:7900HT,美国ABI公司)、全自动生化分析仪(型号:BS-220,南京贝登医疗股份有限公司)、RNA提取试剂盒(货号:9767,日本Takara公司)、反转录试剂盒(货号:RR047A,日本Takara公司)、qRT-PCR试剂盒(货号:RR820A,日本Takara公司)。

三、方法

1.样本采集:所有受试者于入组时清晨(7:00~9:00)空腹采集外周静脉血5 ml,经离心后分离上清液,用于常规指标检测。

于玻璃体切除术时收集所有受试者玻璃体和膜组织。于灌注前用玻璃体切割头收集玻璃体组织0.6 ml,于-80 ℃保存备用。术中收集PDR患眼视网膜前增生膜和对照组内界膜组织,于-80 ℃保存备用。

2.玻璃体和膜组织中各因子表达水平检测:采用qRT-PCR法检测玻璃体和膜组织中lncRNA PVT1、miR-26b、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA表达水平。使用RNA提取试剂盒及反转录试剂盒获得cDNA后,用于qRT-PCR实验。qRT-PCR反应体系如下:ROX 0.4 μl ,SYBR®rimix Ex TaqTM10 μl ,上游引物0.8 μl、下游引物0.8 μl,cDNA 2 μl,dH2O 6.0 μl。具体反应步骤如下:95 ℃、33 s,1循环;95 ℃、5 s;62 ℃、38 s,40循环。每个样本重复3次,用2-△△CT法计算lncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表达水平。qRT-PCR所用引物见表1所示,lncRNA PVT1、VEGF以β-actin为内参基因,miR-26b以U6为内参基因。

表1 qRT-PCR引物序列

3.血清常规指标检测:使用全自动生化分析仪检测所有受试者血清糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteincholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density liptein cholesterol,HDL-C)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)。

四、统计学分析

结 果

一、两组一般资料比较

PDR组和对照组患者年龄、性别比例、体质指数(BMI)值、血清LDL-C水平、TC水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。PDR组血清FBG、HbA1c水平明显高于对照组,HDL-C水平明显低于对照组(P<0.05)。见表1,2。

表2 两组一般资料比较

二、两组患眼玻璃体中lncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表达水平比较

PDR组患眼玻璃体中lncRNA PVT1、VEGF mRNA表达水平明显高于对照组,miR-26b表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组血清FBG、HDL-C、LDL-C、TG、TC、HbAlc比较

三、两组患眼膜组织中lncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表达水平比较

PDR组患眼膜组织中lncRNA PVT1、VEGF mRNA表达水平明显高于对照组,miR-26b表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 两组患眼玻璃体中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平比较

四、PDR组患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平相关性

PDR组患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与miR-26b表达水平呈负相关(r=-0.424,P=0.001;r=-0.449,P=0.000)。见图1,2。

五、DR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平与各临床指标相关性

PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与患者血清FBG、HbA1c、VEGF mRNA呈正相关,与患者血清HDL-C呈负相关(P<0.05)。PDR患眼玻璃体和增生膜中miR-26b表达水平均与患者血清FBG、HbA1c、VEGF mRNA呈负相关,与患者血清HDL-C呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 两组患眼增生膜中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平比较

表6 PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRN APVT1、miR-26b表达水平与各临床指标相关性

讨 论

PDR发病机制复杂,但视网膜新生血管生成是引发PDR关键因素。探寻与视网膜新生血管生成相关因子对明确PDR发病机理、临床有效控制病情进展有重要意义。

lncRNA是一种长度大于200 nt的非编码RNA,可通过转录、表观遗传学修饰等方式参与人体组织修复、疾病调控等过程。有研究表明,lncRNA可参与DR、脉络膜新生血管、增生性玻璃体视网膜病变等眼部增生性疾病进展[7]。lncRNA PVT1位于人类染色体8q24,可通过参与2、22号染色体间复发性易位,参与细胞凋亡及细胞周期调控[8]。本研究结果显示,PDR组患眼玻璃体和膜组织中lncRNA PVT1表达水平明显高于对照组,提示lncRNA PVT1表达水平升高可能与PDR发生有关。Ma等研究发现,lncRNA PVT1在胶质瘤微血管内皮细胞中高表达,可促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成,为胶质瘤抗血管生成治疗提供了靶点[9]。提示lncRNA PVT1可能通过影响视网膜新生血管生成,参与调控PDR发生发展。有研究证实,lncRNA PVT1过表达可影响VEGF表达水平升高,促进血管生成与胃癌微血管密度增大[10]。VEGF是EMT重要调节因子[11],Kashiwagi等研究报道,EMT与肿瘤血管重构密切相关[12]。本研究结果显示,VEGF mRNA在PDR组患眼玻璃体和增生膜中表达水平明显升高,且与lncRNA PVT1表达水平呈正相关,提示lncRNA PVT1可能通过调控VEGF介导的EMT进程,促进视网膜新生血管生成,参与PDR进展。

miRNA是一种具有调控功能的短链非编码RNA,能参与疾病发生发展。研究报道,miRNA与PDR发生及患病严重程度有关,具有成为PDR早期检测生物学标志物的潜力[13]。本研究结果发现,PDR组患眼玻璃体和膜组织中miR-26b表达水平明显低于对照组,提示miR-26b水平降低可能对PDR发生有一定作用。miR-26b属于miR-26家族,与血管平滑肌细胞分化、血管生成及心血管修复密切相关[14]。Wang等研究发现,miR-26b在肝细胞癌组织和细胞系中表达水平显著降低,过表达miR-26b可抑制癌细胞成管能力,促使肿瘤微血管密度下降[15]。提示miR-26b对PDR抑制作用可能与视网膜新生血管生成有关。有研究报道,miR-26b可通过调节VEGF抑制癌细胞侵袭和迁移[16]。研究证实,VEGF与EMT调控有关[11],影响血管生成[17]。Dong等研究表明,人晶状体上皮细胞中miR-26b下调表达促进EMT进展[18]。本研究结果显示,miR-26b与VEGF mRNA表达水平呈正相关,提示本研究中miR-26b下调可能通过影响VEGF水平和EMT,诱导视网膜血管生成,促进PDR发生发展。

Wang等研究发现,lncRNA PVT1在黑色素瘤组织中明显上调,可通过与miR-26b结合,降低miR-26b抑癌作用,促进肿瘤细胞增殖[19]。本研究结果显示,PDR组患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与miR-26b表达水平呈负相关,提示lncRNA PVT1与miR-26b间可能存在相互作用,共同影响PDR进展。

Aryan等研究报道,血清HDL-C水平变化与糖尿病型微血管病变严重程度有关,可作为糖尿病微血管并发症特异性预测因子[20]。Jiang等研究发现,PDR组患者空腹血浆血糖、HbA1c水平明显高于单纯糖尿病组和非增生型DR组[21]。本研究发现,PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与患者血清FBG、HbA1c呈正相关,与患者血清HDL-C呈负相关。PDR患眼玻璃体和增生膜中miR-26b表达水平均与患者血清FBG、HbA1c呈负相关,与患者血清HDL-C呈正相关。进一步提示lncRNA PVT1、miR-26b表达水平异常可能对PDR发生发展有重要影响。

综上所述,PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1水平显著升高、miR-26b水平显著降低,与患者血清FBG、HbA1c及HDL-C水平变化有关,二者之间可能存在相互作用,共同影响PDR进展。但由于本研究样本量较少,具体机制还需进一步实验验证。

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