解毒化瘀颗粒对肝衰竭大鼠的作用机制——肝损伤和肝线粒体自噬蛋白Mfn1、Mfn2的影响

吕建林,毛德文,张文富,陈月桥,张荣臻,潘哲,王海燕

(1.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023； 2.深圳市宝安中医院(集团), 广东深圳518133)

肝衰竭(liver failure，LF)是临床常见的多种因素形成的肝功能严重障碍性，可以迅速发展为多器官衰竭的疾病，具有极高病死率[1]。LF发病原理存在不确定性，当前还缺乏对应结论。外泌体起源于细胞内吞中质膜的内化过程，由多囊泡体(MVB)向内萌芽形成，并在MVB与质膜(PM)融合后从细胞释放到微环境中的一种纳米级的EVs[2-3]。最新研究发现，肝细胞再生过程依赖于线粒体的调控，因此，线粒体合成在肝细胞再生进程中占据重要地位[4]。而近期国外研究结果表明，细胞自噬的调节水平也是细胞再生依托的重要途径[5]，线粒体选择性自噬途径降解缺损线粒体是肝细胞存活和再生的关键机制。

本研究运用的解毒化瘀颗粒全方具清热解毒、活血化瘀之功的临床经验方。本课题前期临床研究证明，解毒化瘀颗粒对肝细胞线粒体的保护作用；并通过调节氧化还原体系保护肝细胞线粒体，抑制肝细胞坏死与凋亡；本方并能通过负向调节作用，减少血清TNF-α、LPS升高而导致的肝细胞损伤[6-7]。在前期研究的基础上，本实验主要观察解毒化瘀颗粒治疗对肝衰竭大鼠肝损伤及线粒体自噬特异性蛋白Mfn1、Mfn2表达的影响。

1 材料

1.1 动物

实验用的180只SPF级Wistar大鼠，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体重(200±20)g，动物合格证号(SCXK[湘]2018- 0002)。实验经广西中医药大学伦理委员会批准，批件号(2018-KY-NSFC-152)，于广西中医药大学SPF动物实验室中饲养，实验室内室温和湿度适中，室内光线和通风良好，大鼠可自由饮食和摄取。

1.2 试验药物

解毒化瘀颗粒由茵陈30 g、白花蛇舌草30 g、赤芍50 g、大黄15 g、郁金15 g、石菖蒲15 g组成，使用中药配方颗粒剂，所有药材经广西中医药大学罗耽副教授鉴定为正品，符合2015年版《中国药典》规范，由广西中医药大学第一附属医院购进，江阴天江药业有限公司中药配方颗粒，按比例配制，给药剂量参照前期研究配制成0.22 g/mL的药液浓度，并收集在干净玻璃瓶中[7]，使用前 37 ℃水浴加热。

1.3 试剂及仪器

D-氨基半乳糖(D-GalN)、脂多糖( LPS)均由美国Sigma公司提供。Mfn2 Antibody、Mfn1 Antibody，Western一抗稀释液、Western二抗稀释液均由美国CST公司提供。

1.4 实验仪器

恒温振荡器SHZ-82A型产自苏州国华企业；台式离心机TG16G型产自上海医用分析仪器厂；TS100 型荧光倒置相差显微镜购于日本 Nikon 公司；DYCZ-24DH 型电泳仪和DYCZ-40D型转膜仪于购自于北京六一生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 实验分组

180只SPF级Wistar大鼠随机分为正常组40只、模型组和解毒化瘀颗粒给药组(JDHYKL组)各70只，造模成功后24 h每组随机选取8只存活大鼠收集标本进行相关标本检测。各组剩余大鼠做存活率观察。

2.2 急性肝衰竭动物模型制备

为保证造模后各组大鼠血清LPS水平的齐同，采用D-GalN + LPS联合制备急性肝衰竭大鼠模型(按D-GalN 800 mg/kg和LPS 0.1 mg/kg的剂量，腹腔注射一次成模)[7]。

2.3 给药方法

鉴于动物模型的时效性，于建模前5天，开始进行灌胃(ig)用药，维持到建模结束后24 h，日均2次，单次间隔12 h，灌胃液体量为每天2 mL/100 g，正常组跟模型组分别给予等量蒸馏水代替。

2.4 取材与标本处理

①肝组织病理变化观察：成模后3 d，脊椎脱臼法处死大鼠，提出肝大叶组织，将其置于10 %甲醛溶液内，且脱水，以石蜡进行填埋，取片，HE染色，生成切片，从显微镜中开展病理学研究。

②肝功指标测定：血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及总胆红素(TBIL)的情况。③Western Blot检测肝组织Mfn1、Mfn2的表达。

2.5 统计学方法

用SPSS 24.0 统计软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差表示，对比前开展正态分布评估，结合方差齐性验证，达到齐性要求则实施单因素方差研究，若满足统计学要求，利用SNK实施进阶对比，以P<0.05 为差异有统计学意义。

3 研究结果

3.1 两组大鼠肝脏组织病理情况

HE染色显示正常组肝组织结构清晰，肝细胞形态完整。而在模型组中的肝脏组织结构紊乱，出现纤维增生情况，并伴有大量炎性细胞浸润，形成假小叶，肝细胞坏死，空泡化，肝窦扩张充血。JDHYKL组肝组织中肝细胞形态结构基本正常，细胞呈直线排列，并形成一些假小叶。与模型组比较，肝细胞坏死、空泡减少。见图1。

(a) 正常组 (b) 模型组 (c) JDHYKL组

3.2 各组大鼠肝功能检测情况

血生化检测结果显示，模型组AST水平与正常组大鼠比较显著增高(P<0.01)；JDHYKL组大鼠AST水平与模型组比较明显下降(P<0.01)。模型组大鼠ALT水平较正常组显著增高(P<0.01)；JDHYKL组大鼠ALT水平较模型组显著降低(P<0.05)。模型组大鼠TBIL数据比正常组明显提高(P<0.05)；JDHYKL组大鼠TBIL数据比模型组差异不符合统计学要求(P>0.05),具体见表1。

表1 各组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平比较1Tab.1 Comparison of serum ALT, AST and TBIL levels of rats in each group

3.3 肝组织Mfn1、Mfn2蛋白的表达

提取肝组织蛋白后，Western Blot评估LF样本组织线粒体外膜结合有关蛋白Mfn1、Mfn2的表达水平。与正常组相比，模型组Mfn1蛋白数据下降明显(P<0.01)，跟模型组对比，JDHYKL干预后Mfn1蛋白表达水平显著上升(P<0.01)。跟正常组比较，模型组蛋白Mfn2表达水平下降且具有统计学差异(P<0.05)，与模型组对比，经JDHYKL干预后，治疗组Mfn2蛋白表达升高水平更为显著(P<0.01)，具体见表2和图2。

表2 肝组织Mfn1、Mfn2的相对表达情况Tab.2 Relative expression of Mfn1 and Mfn2 in liver tissue

图2 肝组织Mfn1、Mfn2蛋白的表达电泳Fig.2 Expression electrophoresis of Mfn1 and Mfn2 proteins in liver tissue

4 讨论

肝衰竭的病理生理机制复杂，当前认为线粒体属于肝组织能量输入的关键亚细胞结构，在保持肝组织代谢均衡上起到关键功能。肝组织线粒体自噬过程中，降解病变线粒体，防止其受损状态下持续放出ROS与控制凋亡诱导因子，从中实现肝组织稳定[8-9]。而在线粒体自噬降解过程涉及线粒体分裂和融合，线粒体的分裂与融合是协同进行的，线粒体裂变环节的蛋白包含蛋白1 ( Drp1)和分裂蛋白1(Fis1)负责，线粒体融合主要通过定位于线粒体外膜的融合蛋白1、2(Mfn1、Mfn2)两者负责。敲除Fis1或负性表达Drp1可减少线粒体自噬[10]，偏高的Fis1能够引发自噬程序[11]。Mfn1跟Mfn2经证明为Parkin的底物，基因敲除Mfn1或Mfn2将引起线粒体片段化的问题[12]，即线粒体损坏，从而促进自噬。

中医药在应对肝衰竭上存在一定的历史，效果良好。中医药能从多靶点、多方面、多层次保护肝细胞。本研究运用的解毒化瘀颗粒，属于毛德文教授参考“毒邪病因”原理打造的临床验方，存在散热解毒等积极作用。现代药理学研究表明茵陈水提物能有效抑制NK-KB激活和抑制线粒体膜电位变化，从而达到抑制胆红素诱导的细胞凋亡[13]。赤芍可以抑制ROS生成和稳定线粒体膜电位，而降低细胞脂质过氧化水平，提高抗氧化酶活力，起到保护细胞的作用[14]。大黄素型蒽醌类化合物包括大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素等物质，可以诱导的Mfn2的表达[15]。

本研究结果显示，经解毒化瘀颗粒治疗后大鼠肝组织肝细胞形态组织结构基本正常，细胞呈条索状排列，部分假小叶形成，肝细胞坏死及空泡化较模型组减轻，并且能够有效控制LF大鼠 ALT、AST，证实药物能够缓解肝脏损害。在FL模型组蛋白表达中，Mfn1和Mfn2的表达水平减少，这表明线粒体结合受到阻碍，致使裂变、损坏较多，而经药物干预后，Mfn1和Mfn2的表达水平均有一定程度提升。证实药物能够在一定程度上增强Mfn1和Mfn2的表达。

综上所述，解毒化瘀颗粒可能是通过上调Mfn1和Mfn2的表达抑制线粒体分裂，推动线粒体结合，降低其碎片化程度，保护线粒体，而对大鼠肝衰竭发挥保护作用。