封闭式载杆与开放式载杆冷冻胚胎的效果比较

冯 清，宋 燕，周志伟

（赣州市人民医院生殖医学科，江西 赣州 341000）

玻璃化冷冻技术因具有复苏率高、无需大型设备、快捷、简便等特点，被广泛应用于辅助生殖技术［1］。玻璃化冷冻技术效果将直接受到降温速率的影响，在玻璃化冷冻过程中，载体的种类直接影响降温速率的高低［2-4］。开放式载杆具有降温迅速、操作简单等优势，复苏率较高，但其直接使胚胎与液氮接触，可能会出现交叉感染、微生物污染等现象。封闭式载杆可防止胚胎与液氮直接接触，阻止病毒在冷冻和储存中可能出现的不同患者胚胎间交叉感染现象［5-6］。本研究回顾性分析我院使用两种载杆全胚冷冻保存卵裂胚的患者首次解冻移植的临床结局，旨在为实验室选择冷冻载杆类型提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2016年1月至2017年12月在我院行体外受精—胚胎移植（IVF-ET）技术助孕445例行全胚冷冻患者（年龄＜37 岁），按冷冻载体不同分为两组。A 组（n=171）行常规促排卵，IVF 受精，第3 d使用封闭式载杆冷冻胚胎；B组（n=274）行常规促排卵，IVF受精，第3 d使用开放式载杆冷冻胚胎。

1.2 主要试剂卵裂胚玻璃化冷冻试剂（RapidVit TM Cleave，Vitrolife），卵裂胚玻璃化解冻试剂（RapidWarmTM Cleave，Vitrolife），胚胎移植 液（EmbryoGlue，Vitrolife）。

1.3 主要仪器与耗材体视显微镜（SMZ800，Nikon，日本），倒置显微镜及显微操作系统（RI，英国），CO2培养箱（Cook，澳大利亚），液氮罐（MVE，美国），冷冻盒（Vitrolife，瑞典），激光封口仪（Vitrolife，瑞典），封闭式载杆（RaPid-I Kit，瑞典），开放式载杆（Kitazato，日本）。

1.4 方法

1.4.1 促排、胚胎培养使用超长方案、拮抗剂方案行超促排卵，注射绒毛膜促性腺激素（HCG）36～38 h 后取卵，注射40～42 h 后授精。授精16～18 h后，对受精情况进行观察。第2 天、第3 天观察卵裂情况。胚胎质量分级：Ⅰ级：细胞大小均匀，透明带完整，形态规则，胞质均匀清晰，细胞质碎片＜5%，无多核、颗粒现象；Ⅱ级：细胞大小略不均匀，胞质有颗粒现象，形态略不规则，细胞质碎片6%～20%；Ⅲ级：细胞大小明显不一，胞质可有颗粒现象，形态明显不规则，细胞质碎片21%～50%；Ⅳ级：细胞大小显著不均，细胞质碎片＞50%，胞质伴有严重的颗粒现象。结合患者年龄、胚胎培养情况全胚冷冻一枚以上Ⅰ级胚胎、Ⅱ级胚胎。

1.4.2 胚胎冷冻将胚胎在室温下放置在含有7.5%乙二醇（EG）、7.5%二甲基亚砜（DMSO）的液体V1 中平衡5 min，随后移至含有15% DMSO、15%EG 液体-V2 中快速清洗3 次以上脱水2 min。在体视镜下，A 组将胚胎移至V3 液中迅速转移3 个位置再置RaPid-I Kit 封闭式载杆上，套上外套管后，立即投入液氮中保存；B 组将胚胎移至V3 液中迅速转移3 个位置再置Kitazato 开放式载杆上，立即投入液氮中保存。两组装载胚胎控制总时间在30 s内。

1.4.3 胚胎复苏从液氮中取出将含有胚胎的载体，A 组取下外套管，将载体快速放置于37 ℃Vitrolife 解冻液1中30 s（含有1.0 mol·L-1蔗糖）。完成后，分别在含有0.5 mol·L-1、0.25 mol·L-1蔗糖的解冻液2 和解冻液3 中稀释，时间分别为1 min，2 min，移至无蔗糖的解冻液4 中平衡5 min。移至5%CO2、37 ℃培养箱中培养2 h。对胚胎存活情况在倒置显微镜下密切观察。存在完整的透明带且超过50%卵裂球存活表示胚胎存活。包膜完整且胞质透光性好表示卵裂球存活。

1.4.4 胚胎移植经诱导排卵周期或自然周期准备子宫内膜，将胚胎在B超引导下移入宫腔，给予黄体支持。移植后14 d 对尿HCG 或血清β-HCG 水平进行检测，检测结果为阳性表示患者为生化妊娠。移植38 d 后行B 超检查，有孕囊和胎心音者表示为临床妊娠。

1.5 观察指标①对比两组胚胎复苏情况包括解冻复苏率、胚胎损伤率；②对比两组移植情况，包括移植周期妊娠率、胚胎着床率、活产率、流产率；③记录两组子代出生情况，包括早产率、出生缺陷率、男女性别比例等。

1.6 统计学方法应用SPSS 21.0 统计软件对数据分析，计数资料以n（%）表示，卡方（χ2）检验，计量资料用表示，t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本情况本研究共纳入行全胚冷冻首次解冻移植周期445 例，封闭式载杆与开放式载杆组的患者在年龄、移植日内膜、移植胚胎数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 胚胎复苏情况A 组胚胎解冻复苏率略低于B 组，胚胎损伤率略高于B 组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 两组患者基线资料比较

2.3 移植情况A组冷冻胚胎复苏171个周期，移植171个周期；B组冷冻胚胎复苏274个周期，移植274个周期。A组移植周期妊娠率略高于B组、胚胎着床率略低于B组，差异无统计学意义（P＞0.05）；A组流产率略高于B组，差异无统计学意义（P＞0.05）。B组活产率高于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 两组胚胎复苏情况比较/%

表3 两组移植情况比较/%

2.4 子代出生情况A 组出生缺陷率、男活胎分娩率略高于B 组，A 组早产率略低于B 组，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 两组出生情况比较/%

3 讨 论

胚胎冷冻是人类辅助生殖技术的重要技术手段之一，能为患者保存胚胎，提高患者累积妊娠率和降低费用。玻璃化冷冻技术是指液态的高浓度冷冻保护剂在快速降温过程中变成极其黏稠且无结构的固化状态，在冷冻过程中无冰晶形成，可避免细胞受冰晶物理化学损害［7］。快速降温是影响玻璃化冷冻成功的关键，其克服了慢速冷冻的不足，简化了冷冻的操作步骤，使冷冻时间缩短，同时无需昂贵的冷冻仪器，可使细胞的冷冻损伤减少，使胚胎冷冻复苏效率提高［8］。

胚胎评级、患者年龄、子宫内膜情况、移植胚胎数目与胚胎解冻复苏情况、临床妊娠情况密切相关。本研究选择年龄在37岁以内，行全胚冷冻的患者按使用载杆类型分组。两组患者年龄一般情況均无统计学差异，可以说明两者一般情况基本一致。纳入研究周期的冷冻解冻过程由两名完成200次以上人类胚胎冷冻解冻临床操作经验的胚胎师随机操作。操作人员对载杆使用、试剂使用和标准化操作规程非常熟练并严格执行，尽量消除了研究过程中的由操作人员引起的实验误差。

两组复苏情况比较，A 组复苏率略低于B 组，胚胎损伤率略高于B 组，表明两种载杆有相似的冷冻解冻效果；两组移植情况比较，临床妊娠率、着床率、流产率无统计学差异，但A 组较B组临床结局都略差一些，提示封闭式载杆较开放式载杆冷冻解冻胚胎的效果略差些。B 组活产率高于A 组（48.18%vs 44.44%），研究结果与周俊等［9］的研究相似。

玻璃化冷冻载杆分为封闭式与开放式冷冻载杆。开放式载杆实施胚胎冷冻保存时，胚胎与液氮直接接触，玻璃化形成速度较快，但液氮中可能含有感染性疱疹病毒、乳头状瘤病毒等，会增加冷冻胚胎交叉感染风险。与开放式载杆相比，封闭式载杆可从根本上杜绝胚胎之间的交叉感染、潜在的病原微生物感染，但其体外操作时间稍长、降温速率较慢［10］。封闭式载杆降低了降温速率，是否能维持较好的冷冻效果是辅助生殖医生关注的焦点。RaPid-I Kit 封闭式载杆的前端是一个微小的圆孔，冷冻时，移动胚胎至孔里，利用冷冻液在圆孔的张力装载胚胎。装好胚胎后再套上外套管封口后置入液氮，避免胚胎与液氮直接接触。它较开放式载杆具有以下优势：（1）圆孔的体积固定，限定了转载胚胎的冷冻液体积，提高了操作稳定性和均一性，限定了降温速率。（2）载杆封口可降低冷冻和存贮过程中液氮或液氮蒸汽带来的病原体交叉感染风险。每管胚胎独立操作和存贮，互不影响。但装载胚胎的圆孔转载胚胎时冷冻液装载超过限定体积，胚胎有从圆孔漏出的风险。封闭载杆的设计步骤比开放式载杆更多，要求实验员需经大量训练才能掌握操作技巧。而且在一项荟萃分析中，在比较开放式和不同封闭式载杆，胚胎每转移一次，活产率有下降的趋势［11］。本研究也显示封闭式载杆较开放式载杆有更低的活产率。Kitazato 开放式载杆的前端是一个小薄片，冷冻时直接将胚胎置于薄片上再将薄片直接放于液氮中套上外套管。此种载杆载体轻薄且冷冻时直接接触液氮因而可快速传导热量，胚胎降温速度极快。在放入解冻液滴中也可迅速复温，变温速度较为恒定和均匀且操作简单省时，实验员易于掌握和操作，但存在交叉感染的风险。

本实验由于尚处于探索阶段，临床样本还不够大，胎儿出生感染情况等数据还有待进一步挖掘。综上所述，在实验员熟练掌握载杆操作和严格执行操作规程情况下，封闭式载杆冷冻胚胎、开放式载杆冷冻胚胎有相似的冷冻解冻效果，但开放式载杆有更高的活产率。临床可根据患者情况和各中心情况选择适宜的冷冻载杆。